一种在微生物基因组上多拷贝整合目的基因的方法及应用

本发明属于生物，尤其涉及一种在微生物基因组上多拷贝整合目的基因的方法及应用。

背景技术：

1、本部分的陈述仅仅是提供了与本发明相关的背景技术信息，不必然构成在先技术。

2、大肠杆菌由于其生长速度快、遗传工具可用性强和成熟的高密度培养技术等优势成为有利的底盘生物。在工程菌株的构建中外源或同源基因的表达至关重要。基因在大肠杆菌中过表达的常用方法为质粒和基因组整合，其中基因组整合可以弥补质粒表达的容量限制、遗传不稳定性及需要压力维持等缺陷，是构建稳定高效工程菌株的更优选择，且为提高整合基因的表达强度，多拷贝基因组整合更具有前景。

3、目前有多种方法将基因多拷贝整合到大肠杆菌菌株的基因组中。化学诱导染色体(ciche)和多拷贝基因染色体整合(cigmc)技术等技术利用同源重组(hr)和位点特异性重组(ssr)分别开发了多拷贝基因整合。然而，单个位点整合往往由于串联长重复序列而导致基因组不稳定。来自噬菌体的重组酶，主要是来自rac原噬菌体的recet和λ噬菌体的redaβγ，促进了多重细菌基因组工程，包括多重自动基因组工程(mage)、可追踪多重重组(trmr)、随机基因组突变定向进化(diverge)和portmage等技术。wang等人通过优化细胞内dntp水平进一步提高了这些重组酶的效率，并开发了双链dna重组辅助多重基因组工程(dreamge)方法，能够在千碱基尺度上在多个位点插入目标dna片段进行多拷贝。最新的crispr相关转座子系统可实现在不需要宿主同源重组系统帮助的情况下成功地将靶基因多重插入宿主染色体。yang的团队基于正交crispr相关转座子系统实现了基因的多拷贝插入。

4、目前的多拷贝整合方法旨在实现位点特异性插入，然而整合位点的选择仍然具有挑战性。基因组中不同整合位点之间的表达水平经常存在实质性差异。因此，事先选择和筛选合适的基因座是必要的，由于缺乏预测软件，这可能是费力且耗时的。此外，多拷贝插入目的基因会将大量重复序列引入基因组，如果整合位点是重组热点，则可能导致大规模的基因组缺失和重排，进而影响基因组整合的稳定性。这个问题使选择合适的整合位点进一步复杂化。在这种情况下，快速识别多个高效且稳定的插入位点可以缓解与当前方法相关的瓶颈。

5、转座酶使外源dna能够随机整合到目标基因组且已被用于鉴定基因组中的高表达活性位点。两种常用的转座酶来源于mu噬菌体和tn5转座子。这些转座酶识别特定的目标dna序列末端，促进目标dna随机整合到细菌基因组。wei等人利用mini-mu和flp/frt位点实现了多轮的抗性基因插入和替换，在三轮插入中成功地将三个不同的基因插入细菌基因组。zhang等人利用mini-tn5将来自zoogloea ramigera的聚羟基丁酸酯(polyhydroxybutyrate，phb)合成基因插入到基因组中，从而在遗传稳定的背景下增加了phb的产生。此外，利用tn5转座酶将ralstonia eutropha h16的phb合成基因插入大肠杆菌基因组中，获得了高phb产率。然而，利用转座酶进行基因组多拷贝整合的研究仍然相对较少。

技术实现思路

1、为克服上述技术的不足，本发明提供了一种在微生物基因组上快速多拷贝整合目的基因的方法及其应用。本发明中所述方法，将mini-tn5转座系统和flp/frt位点结合，通过诱导表达及共孵育培养获得重组菌株，在不同的大肠杆菌菌株中实现目标dna的随机多拷贝整合。在没有施加选择压力的情况下，能够稳定地表达多达19个egfp基因拷贝和12个phb合成基因拷贝。

2、为实现上述目的，本发明的一个或多个实施例提供了如下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供一种在微生物基因组上快速多拷贝整合目的基因的方法，所述方法包括如下步骤：

4、1)构建含有转座酶tn5识别位点me、位点特异性重组酶flp的识别位点frt及目的基因和标记基因的第二质粒，并将第二质粒转化至菌株mfdpir中获得供体菌株；

5、2)构建可以诱导表达转座酶tn5的第一质粒，并转化至出发菌株获得受体菌株；

6、3)诱导受体菌株表达转座酶tn5获得诱导后受体菌株；

7、4)将诱导后受体菌株与供体菌株混合后共孵育获得结合子；

8、5)删除步骤4)中的第一质粒，引入含有位点特异性重组酶flp的第三质粒；

9、6)在41℃-44℃条件下培育步骤(5)所得菌株，去除第三质粒；

10、7)将步骤6)所得菌株作为新一轮的目标菌株，重复步骤2)-6)；

11、8)重复步骤7)≥2次获得多拷贝整合目的基因菌株；优选2-6次；更优选6次。

12、其中，目的基因可以为荧光蛋白编码基因，如egfp，可以为任意的编码目标产物的基因，如phbcab基因簇。第二质粒采用r6k复制子；第一质粒采用psc101 ori复制子。

13、在本发明的具体实施方式中，所述步骤2)中第一质粒为pkd46-cmr::ptrc-tnpa；所述出发菌株为大肠杆菌；

14、所述步骤1)中第二质粒为pkd4::mob-me-plac-egfp-frt-kan-frt-me或pkd4::mob-me-ptac-phbcab-frt-kan-frt-me。

15、在本发明的具体实施方式中，所述步骤3)中，诱导表达条件为含0.8-1.2mm iptg的lb培养基中，在30℃下培养时间可以为1、2、4或6小时，优选为2小时；。

16、在本发明的具体实施方式中，所述步骤4)中，诱导后的受体菌株与供体菌株的比例为1:5、1:3、1:2、1:1、2:1或4:1；优选为1:3；

17、在本发明的具体实施方式中，所述步骤4)中，在结合转移操作中需要将供体菌和受体菌按照一定比例混合并浓缩。在100μl浓缩后的混合菌液体系中，供体菌株mfdpir的菌体浓度可以为od600(分光光度计测定的在600nm条件下的吸光度)等于0.67、1.67、3.33、10、20或30，优选为20。

18、在本发明的具体实施方式中，所述步骤4)中，共孵育条件为：诱导后的受体菌株与供体菌株细胞悬液浓缩，并置于1mm iptg和0.3mm dap的lb板上在30℃下培养2、4、6、16、20或24小时，优选为20小时。

19、在本发明的具体实施方式中，所述步骤5)中，所述删除步骤4)中第一质粒的条件为：41℃-44℃下孵育过夜；

20、所述第三质粒为pcp20，以表达flp，诱导frt位点重组，去除标记基因。

21、在本发明的具体实施方式中，所述步骤2)中大肠杆菌包含mg1655、xl1-bluemrf'、bl21(de3)或mach1。

22、在本发明的具体实施方式中，所述pkd46-cmr::ptrc-tnpa质粒中包括转座酶tn5的表达盒及筛选标记；

23、所述pkd4::mob-me-plac-egfp-frt-kan-frt-me或pkd4::mob-me-ptac-phbcab-frt-kan-frt-me中至少包括结合转移蛋白编码基因mob、两个me位点、两个frt序列及其中间的标记基因和目的基因表达盒；

24、优选的，所述pkd46-cmr::ptrc-tnpa的核酸序列如seq id no.1所示；

25、所述质粒pkd4::mob-me-plac-egfp-frt-kan-frt-me的序列如seq id no.2所示。

26、所述质粒pkd4::mob-me-ptac-phbcab-frt-kan-frt-me的构建方法为将seq idno.3所示的ptac-phbcab片段替换pkd4::mob-me-plac-egfp-frt-kan-frt-me中的plac-egfp获得。

27、本发明的第二方面，提供第一方面所述方法在制备多拷贝外源基因插入工程菌中的应用，其特征在于，所述工程菌以大肠杆菌为出发菌株；所述大肠杆菌包含mg1655、xl1-blue mrf'、bl21(de3)或mach1；优选为mg1655。

28、本发明的第三方面，提供一种新型mini-tn5工具，所述mini-tn5工具包括反式作用的mini-tn5转座子及flp/frt重组系统；反式作用是指表达转座酶的基因序列和其识别的dna序列不在同一个质粒上。

29、所述mini-tn5工具还包括供体菌株和受体菌株；

30、所述供体菌株为mfdpir，所述受体菌株为mg1655或xl1-blue mrf'；

31、具体的，所述快速多拷贝整合目的基因的系统包括三个质粒第一质粒、第二质粒及第三质粒；

32、所述第一质粒包括表达转座酶tn5的表达盒及筛选标记；

33、所述第二质粒包括结合转移蛋白编码基因mob、me位点、两个frt序列及其中间的标记基因和目的基因表达盒；

34、所述第三质粒包括位点特异性重组酶flp的表达盒；

35、进一步，所述第一质粒、第三质粒及第二质粒分别为pkd46-cmr::ptrc-tnpa、pcp20、pkd4::mob-me-ptac-phbcab-frt-kan-frt-me或pkd4::mob-me-plac-egfp-frt-kan-frt-me；

36、所述pkd46-cmr::ptrc-tnpa核酸序列如seq id no.1所示；所述pkd4::mob-me-plac-egfp-frt-kan-frt-me核酸序列如seq id no.2所示；pkd4::mob-me-ptac-phbcab-frt-kan-frt-me为seq id no.4所示；

37、所述pkd46-cmr::ptrc-tnpa质粒中至少包括表达转座酶tn5的表达盒及筛选标记；

38、所述pkd4::mob-me-ptac-phbcab-frt-kan-frt-me中至少包括结合转移蛋白编码基因mob、me位点、两个frt序列及其中间的标记基因和目的基因表达盒；

39、所述pcp20质粒中至少包括位点特异性重组酶flp的表达盒；

40、所述出发菌株包括供体菌株和受体菌株。

41、以上一个或多个技术方案存在以下有益效果：

42、本发明成功地设计了一种高效的双组分体内mini-tn5元件。使用这个工具，以及多轮接合转移、flp/frt介导的抗性标记替代和特异性筛选方法，成功构建了高表达绿色荧光蛋白或增强phb产量的稳健工程菌株。

43、本发明方法有效地将目标基因以随机和稳定的方式插入大肠杆菌基因组的多个拷贝中，这些目标基因在多个整合位点表现出较高的表达活性和强大的遗传稳定性。尤其在mg1655中，在没有施加选择压力的情况下，能够稳定地表达多达19个egfp基因拷贝和12个phb合成基因拷贝。

44、此外，该方法具有应用于不同菌株的潜力，不影响其在菌株中的遗传稳定性，可用于生产高效稳定的微生物细胞工厂，在生物技术、生物制药和生物工程领域有着广泛的应用。

45、本发明附加方面的优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。