一种基于枸杞原生质体的瞬时转化的方法

本发明涉及生物，更具体的说是涉及一种基于枸杞原生质体的瞬时转化的方法。

背景技术：

1、枸杞(l.barbarum)是茄科植物的一种木质属，原产于中国，并在全球范围内广泛栽培。枸杞浆果因其营养成分和健康益处而备受重视，深受消费者喜爱。现代临床研究已经从理论上证明了枸杞浆果的关键营养功能，因此它们被广泛用于酿造、饮料和许多其他健康食品中。然而，由于传统育种面临的障碍，可供选择的高质量枸杞品种很少。作为杂交传粉植物，枸杞的遗传背景高度杂合，改良枸杞浆果的质量是一项长期而复杂的任务。尽管对整个枸杞基因组的测序为将来的分子生物学研究提供了基础，但由于缺乏可靠的转化系统，该过程仍然缓慢。因此，需要一个方便高效的转化系统以克服这一限制，加快基因功能的验证，并加速培育新的多用途枸杞品种。

2、原生质体是没有细胞壁的裸露植物细胞，具有多能性，可以容易地吸收外源基因元素，如dna、染色体、细胞器和病毒颗粒。原生质体培养为研究植物细胞的生理学和遗传学，包括细胞壁形成与再生以及体细胞杂交等提供了有价值的工具，为开发新品种提供了一种新方法。原生质体的短暂转化是基因分析的最佳方法，因为它允许将外源基因引入受体细胞，从而在短时间内获得高表达产物。短暂原生质体转化可用于功能研究，如亚细胞定位、蛋白质相互作用、启动子活性分析和sgrna筛选。暂时转化的技术包括颗粒轰击法、生物弹射法、农杆菌浸渍法和电转染。由于peg介导的转染具有易于使用、广泛适用、效率相对稳定、简单和设备要求低廉等优点，它已被广泛应用于植物分子生物学研究。原生质体的分离和转化已成功应用于多种植物中，包括拟南芥、水稻和黑麦草。还报道了对茄科植物如烟草、番茄和四倍体马铃薯进行原生质体转化。关于枸杞，已经进行了一些原生质体分离和培养技术的初步研究，但暂时基于原生质体转化的研究仍未见报道。在验证l.barbarum基因功能的早期阶段，利用农杆菌介导感染的方法瞬态转化模式植物，如烟草。虽然这项技术比转基因操作更快，但它仍然是一个非同源系统，无法完全揭示最真实的基因表达模式。

3、综上，如何提供一种枸杞浆果高效的同源基因表达系统是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种基于枸杞原生质体的瞬时转化的方法。

2、本发明应用了“胶带三明治法”和甘露醇预处理，显著提高了酶解效率。通过优化影响原生质体分离的操作步骤、酶解时间和甘露醇浓度等参数，我们得到了高收率、活性良好的原生质体作为起始材料。随后，通过优化原生质体转化效率因子，建立了稳定的原生质体转化系统。我们首次开发了枸杞叶肉原生质体的高效分离方法，并建立了瞬时转化系统。在这个基础上，我们进一步研究了osbzip52基因的亚细胞定位。该方法为体内分子研究提供了一种简便而稳定的工具。

3、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

4、一种枸杞原生质体的制备方法，包括如下步骤：

5、(1)取无菌枸杞叶片，采用“胶带三明治法”剥离下表皮，之后在0.5m甘露醇溶液中浸泡30min，得预处理叶片；

6、(2)使用酶液避光消化预处理叶片，时间4小时；

7、(3)加入w5溶液结束消化，离心，收集沉淀，洗涤。

8、进一步的，所述酶液包括如下组分：质量浓度1.5％的纤维素酶r-10、质量浓度0.75％的离析酶r-10、0.5m甘露醇、10mm cacl2、20mm kcl、20mm mes和质量浓度0.1％的bsa，ph 5.7

9、进一步的，所述步骤(2)中在28℃、40rpm下消化处理。

10、进一步的，所述w5溶液包括如下组分：154mmol/l nacl、125mmol/lcacl2、5mmol/lkcl、2mmol/l mes，ph 5.7。

11、进一步的，步骤(3)中所述离心为4℃下100×g离心3分钟。

12、一种基于枸杞原生质体的瞬时转化的方法，包括如下步骤：

13、(1)将上述的制备方法制备的枸杞原生质体与表达质粒混合，且二者体积比为10:1，之后加入等体积的peg转化溶液；

14、(2)避光孵育，之后加入w5溶液，离心收集转化后原生质体。

15、进一步的，所述枸杞原生质体的收率大于1×106g-1fw且活力比率超过80％。

16、进一步的，所述表达质粒的浓度为1μg/μl。

17、进一步的，所述peg转化溶液包括如下组分：质量浓度30～40％的peg 4000、0.2m甘露醇和100mmol/l氯化钙。

18、进一步的，孵育时间为20min。

19、经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明取得的有益效果为：组培叶片只需一次取材，后期便可循环继代使用，操作简便且可常年进行。且该方法制备的原生质体收率大、活力高，利用枸杞原生质体为受体进行转化，红色荧光蛋白rfp和绿色荧光蛋白gfp能成功表达，建立了枸杞同源基因表达系统，解决了枸杞只能在其他植物中异源表达的问题。

技术特征：

1.一种枸杞原生质体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述酶液包括如下组分：质量浓度1.5％的纤维素酶r-10、质量浓度0.75％的离析酶r-10、0.5m甘露醇、10mm cacl2、20mm kcl、20mmmes和质量浓度0.1％bsa，ph 5.7

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中在28℃、40rpm下消化处理。

4.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述w5溶液包括如下组分：154mmol/lnacl、125mmol/l cacl2、5mmol/l kcl、2mmol/l mes，ph 5.7。

5.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述离心为4℃下100×g离心3分钟。

6.一种基于枸杞原生质体的瞬时转化的方法，其特征在于，包括如下步骤：

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述枸杞原生质体的收率大于1×106g-1fw且活力比率超过80％。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述表达质粒的浓度为1μg/μl。

9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述peg转化溶液包括如下组分：质量浓度30～40％的peg 4000、0.2m甘露醇和100mmol/l氯化钙。

10.如权利要求6所述的方法，其特征在于，孵育时间为20min。

技术总结本发明公开了一种基于枸杞原生质体的瞬时转化的方法。属于生物技术领域。本发明采用了枸杞的“胶带三明治法”在无菌叶片上去除下表皮，并在酶解前使用甘露醇预处理。只需4小时即可获得2.34×10<supgt;6</supgt;g<supgt;‑1</supgt;·FW的原生质体，活力比率达91.26％。通过将原生质体与含有质粒DNA的溶液在40％PEG4000和0.2M甘露醇的条件下孵育20分钟，实现了约40％的转染效率。此外，采用亚细胞定位研究验证了转化系统的可靠性和有效性。本发明建立了一种高效的枸杞原生质体分离和PEG介导转化系统，为分子研究奠定了基础，并提供了一种新的转化途径，可用于后续的生物育种工作。技术研发人员：樊云芳,陈晓军,李姝瑶,戴国礼,秦小雅,尹跃,梁晓婕受保护的技术使用者：宁夏农林科学院枸杞科学研究所技术研发日：技术公布日：2024/6/13