一种抗肿瘤树突细胞复合物及其制备方法和应用

本发明属于生物免疫，具体涉及一种抗肿瘤树突细胞复合物及其制备方法和应用。

背景技术：

1、树突细胞(dendritic cell，dc)是体内最重要也是最强大的抗原提呈细胞。dc可分为组织来源dc和外周血来源dc。组织来源的dc是从外周组织中迁徙到淋巴结，在感染中处于不稳定状态。外周血来源的dc的整个生命周期都存在于脾脏和淋巴结。这两类dc也可以再加以细分，在不同成熟阶段的抗原提呈能力表现出根本的不同。dc与肿瘤的关系密切，肿瘤微环境中dc的数量、功能与患者预后呈正相关。dc及肿瘤浸润dc(tidc)的数量、功能与肿瘤的预后呈正相关。患者肿瘤组织中tidc的表达结果显示dc浸润程度与患者远处淋巴结和腹腔转移以及病情恶化程度呈负相关。

2、负载特定肿瘤抗原的dc疫苗能够诱导特异性抗肿瘤反应，消除肿瘤或使肿瘤不再继续进展，制备dc疫苗以肿瘤抗原刺激dc用于肿瘤治疗的研究已不断成熟，相关的基础和临床研究也取得了可观的结果。但是，目前的dc肿瘤疫苗经过一段时间后，其抗肿瘤效应会下降，仍不能根治肿瘤，阻止肿瘤复发或转移，也未能显著提高生存率。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供在于弥补现有技术的不足，提供一种抗肿瘤树突细胞复合物及其制备方法和应用，激活较强的特异性免疫应答，提高对肿瘤的杀伤能力。

2、本发明提供了一种树突细胞复合物，所述树突细胞复合物包括树突细胞和负载于所述树突细胞的肿瘤干细胞的抗原；

3、所述肿瘤干细胞的抗原为肿瘤干细胞的次氯酸裂解产物；

4、所述肿瘤干细胞为肿瘤细胞经悬浮培养所得；所述悬浮培养使用的培养基为dmem/f12培养基。

5、优选的，所述树突细胞包括小鼠骨髓来源树突细胞。

6、优选的，所述悬浮培养的步骤包括：

7、将肿瘤细胞在60～80rpm的条件下培养2～4h后调节转速至80～100rpm继续培养，隔日更换新的培养基，直至培养至第7～12天，收集肿瘤细胞球；使用70μm～90μm细胞筛过滤所述肿瘤细胞球，收集筛下物，得到肿瘤干细胞。

8、本发明还提供了上述技术方案所述的树突细胞复合物的制备方法，包括如下步骤：

9、对肿瘤细胞进行悬浮培养，获得肿瘤干细胞；

10、利用次氯酸裂解所述肿瘤干细胞，得到的次氯酸裂解产物为肿瘤干细胞的抗原；

11、将所述肿瘤干细胞的抗原负载于树突细胞，得到所述树突细胞复合物。

12、优选的，所述裂解时，所述次氯酸溶液的体积和肿瘤干细胞的个数比为1ml：1×106个；

13、所述次氯酸溶液中次氯酸的浓度为2～5μmol/l。

14、优选的，所述负载的方式包括：将含有树突细胞的培养液和肿瘤干细胞的次氯酸裂解产物混合，37℃，co2浓度5v/v％，孵育过夜；

15、所述含有树突细胞的培养液的制备方法包括：裂解骨髓细胞，将裂解后的细胞接种至dc培养基中培养6天；

16、所述dc培养基以1640培养基为基础培养基，包括10v/v％fbs、1v/v％青霉素-链霉素、20～40ng/ml gm-csf、10～20ng/ml il-4和50nmβ-巯基乙醇。

17、优选的，所述裂解骨髓细胞时，使用的裂解液包括氯化铵；所述裂解的时间为10～15min。

18、优选的，所述含有树突细胞的培养液中的细胞数量和用于制备所述次氯酸裂解产物使用的肿瘤干细胞的细胞数量的比为1：1～1：2。

19、本发明还提供了上述技术方案所述的树突细胞复合物在制备抗肿瘤产品中的应用。

20、本发明还提供了一种抗肿瘤树突细胞疫苗，所述抗肿瘤树突细胞疫苗的活性成分包括上述技术方案所述的树突细胞复合物。

21、有益效果：

22、本发明利用dmem/f12培养基对肿瘤细胞进行动态悬浮培养，无需添加任何的生长因子和病毒，只是依靠机械力，培养得到肿瘤干细胞具有自我更新能力和强致瘤性；利用次氯酸裂解悬浮培养所得的肿瘤干细胞后，可获得含广泛肿瘤抗原的裂解物，具有激发免疫反应全面而强烈的优点；同时树突细胞疫苗可以解决靶向肿瘤干细胞的异质性难题。本发明将普通贴壁细胞的次氯酸裂解产物、悬浮培养得到的肿瘤干细胞的次氯酸裂解产物，分别负载于树突细胞，负载肿瘤干细胞的次氯酸裂解产物的树突细胞具有更强的免疫原性，安全性好，促进树突细胞活化递呈抗原，激活较强的特异性免疫应答，对肿瘤细胞有更强的杀伤能力。

技术特征：

1.一种树突细胞复合物，其特征在于，所述树突细胞复合物包括树突细胞和负载于所述树突细胞的肿瘤干细胞的抗原；

2.根据权利要求1所述的树突细胞复合物，其特征在于，所述树突细胞包括小鼠骨髓来源树突细胞。

3.根据权利要求1或2所述的树突细胞复合物，其特征在于，所述悬浮培养的步骤包括：

4.权利要求1～3任一项所述的树突细胞复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述裂解时，所述次氯酸溶液的体积和肿瘤干细胞的个数比为1ml：1×106个；

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述负载的方式包括：将含有树突细胞的培养液和肿瘤干细胞的次氯酸裂解产物混合，37℃，co2浓度5v/v％，孵育过夜；

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述裂解骨髓细胞时，使用的裂解液包括氯化铵；所述裂解的时间为10～15min。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述含有树突细胞的培养液中的细胞数量和用于制备所述次氯酸裂解产物使用的肿瘤干细胞的细胞数量的比为1：1～1：2。

9.权利要求1～3任一项所述的树突细胞复合物或权利要求4～8任一项所述的制备方法得到的树突细胞复合物在制备抗肿瘤产品中的应用。

10.一种抗肿瘤树突细胞疫苗，其特征在于，所述抗肿瘤树突细胞疫苗的活性成分包括权利要求1～3任一项所述的树突细胞复合物或权利要求4～8任一项所述的制备方法得到的树突细胞复合物。

技术总结本发明属于生物免疫技术领域，具体涉及一种抗肿瘤树突细胞复合物及其制备方法和应用。本发明利用DMEM/F12培养基对肿瘤细胞进行动态悬浮培养，无需添加任何的生长因子和病毒，只是依靠机械力，培养得到肿瘤干细胞具有自我更新能力和强致瘤性；利用次氯酸氧化裂解肿瘤干细胞，可获得含广泛肿瘤抗原的裂解物，具有激发免疫反应全面而强烈的优点；将裂解得到的肿瘤干细胞的抗原负载于树突细胞，可以解决靶向肿瘤干细胞的异质性难题，具有更强的免疫原性，安全性好，能够促进树突细胞活化递呈抗原，激活较强的特异性免疫应答，对肿瘤细胞有更强的杀伤能力。技术研发人员：刘继彦,朱亚娟,杨杉杉,牟晓丽,杜杨受保护的技术使用者：四川大学华西医院技术研发日：技术公布日：2024/6/13