制备脱(64，65)胰岛素原的方法

专利名称：制备脱(64，65)胰岛素原的方法美国专利No.4，569，792公开了由人胰岛素原转化得到的新的化合物，这些化合物之一称为脱(64，65)-人胰岛素原脱[(64，65)HPI]，它具有下述结构 前述化合物不同于人胰岛素原在于去除含由二硫键连接形成的双链分子的氨基酸64和65，在某种意义上类似于人的胰岛素。该分子显示类胰岛素活性，因此，可用于治疗糖尿病。美国专利No.4，569，792介绍的脱(64，65)HPI，可从人胰岛素原(HPI)经两步反应顺序制得，首先用胰蛋白酶处理人胰岛素原，产生的物质中包括(65-A1裂开)HPI，用羧肽酶B处理提纯的(65-A1裂开)HPI，可得到要求的脱(64，65)HPI。Given等人在J.Clin.Invest.76，1398-1405页(1985年)中介绍一步法从HPI制备脱(64，65)HPI。该方法包括在pH7.5的三羟甲基氨基甲烷缓冲液存在下，于22℃用胰蛋白酶和羧肽酶B处理HPI(见1399页，第1栏)。这一方法形成的脱(31，32)HPI与脱(64，65)HPI之比约为3∶1(见1400页，第2栏)。现已揭示制备脱(64，65)HPI的有效而简易的方法，这一方法能以高产量将人胰岛素原一步转化为脱(64，65)HPI。实施本发明方法时，可以采用任何或全部大量的参数。本发明提供在胰蛋白酶和羧肽酶B存在下，通过消化人胰岛素原制备脱(64，65)-人胰岛素原的方法，该方法包括在下述一种或几种条件下进行消化。所述条件为a)应用烷化或酰化胰蛋白酶;b)温度约为0℃至10℃;c)pH约为8至10;d)应用选自碳酸氢铵和甘氨酸的缓冲液。由本发明方法制备的化合物具有如前所示结构，对氨基酸可采用标准的三字母简写名称，也可用其已确认的单字母名称。这些名称如下所述单字母 三字母 氨基酸A Ala 丙氨基R Arg 精氨酸N Asn 天冬酰胺D Asp 天冬氨酸C Cys 半胱氨酸E Glu 谷氨酸Q Gln 谷氨酰胺G Gly 甘氨酸H His 组氨酸I Ile 异亮氨酸L Leu 亮氨酸K Lys 赖氨酸F Phe 苯丙氨酸P Pro 脯氨酸S Ser 丝氨酸T Thr 苏氨酸Y Tyr 酪氨酸V Val 缬氨酸根据本发明方法，由人胰岛素原制备脱(64，65)HPI。人胰岛素原可通过各种途径得到，包括有机合成、用常规方法分离人胰腺以及最近采用的重组体DNA方法。广义而言，采用重组DNA方法制备胰岛素原包括无论是通过分离、构建，还是两者的结合，都包含常规的方法，均可得到编码人胰岛素原氨基酸顺序的DNA顺序，然后，将编码人胰岛素原的DNA插入适宜的克隆载体，该载体用来转化适宜的微生物，此后，将转化的微生物进行发酵，产生含人胰岛素原基因载体的附加复制，接着将编码人胰岛素原的DNA从克隆载体上切下，并且以适当的读码位插入表达载体，该表达载体用来转化适宜的微生物，此后，转化的微生物进行发酵，导致相应于人胰岛素原氨基酸顺序或含相应于人胰岛素原的氨基酸顺序的表达。结果，表达产物含有人胰岛素原的氨基酸顺序，不管是外来的还是常规的由已插入人胰岛素原基因的基因顺序表达的产物，一般都含有在其氨基末端与另一肽或蛋白质连接的人胰岛素原氨基酸顺序。若需人胰岛素原氨基酸顺序连接到另一顺序，则连接到充分可断开位点(典型的是蛋氨酸)的这种顺序中。这一产物通常称之谓融合基因产物。假设蛋氨酸是断开位点，则用溴化氰将人胰岛素原氨基酸顺序融合基因产物断开，然后，通过转化为其相应的S-磺酸盐，使人胰岛素原氨基酸顺序的半胱氨酸巯基部分稳定。提纯所得人胰岛素原S-磺酸盐，然后可采用例如美国专利No.4，430，266的方法，通过形成三个适当位置的二硫键，使纯化的人胰岛素原S-磺酸盐转化为人胰岛素原，接着用识别法提纯所得人胰岛素原产物。如上所述，本发明方法包括在胰蛋白酶和羧肽酶B存在下，消化人胰岛素原。业已发现，在消化过程中采用的某些物料和/或条件，无论是单独应用还是组合应用，均使产生的脱(64，65)HPI的量显著提高或不希望的副产物显著减少。典型的不希望的副产物是由于HPI在另一预期断开位点上的断开而产生的，即去掉氨基酸残基31和32使其断开，结果形成脱(31，32)HPI。参数之一涉及所用胰蛋白酶的种类，业已发现，经预处理的胰蛋白酶保护住它的赖氨酸残基的ε-氨基，从而提供了极好的结果。适宜的保护基团是酰基、烷基、烷氧基等。因此，胰蛋白酶可改进为乙酰胰蛋白酶、三氯乙酰胰蛋白酶、氯乙酰胰蛋白酶、三氟乙酰胰蛋白酶、甲酰胰蛋白酶、氨基甲酰胰蛋白酶、叔丁氧基羰基胰蛋白酶、苄氧羰基胰蛋白酶、苯氨羰基胰蛋白酶、琥珀酰胰蛋白酶、邻苯二甲酰胰蛋白酶、丙酰胰蛋白酶等。另外，该胰蛋白酶可以用甲基、乙基、丙基等在ε-氨基上烷基化，也可采用其它试剂用来保护胰蛋白酶的ε-氨基。这种改进的胰蛋白酶很容易制备，例如，酰化胰蛋白酶的制备，即将未改进的胰蛋白酶与相应的酰基酐反应而制得。乙酰化牛胰蛋白酶是最普通的市售商品，它可由牛胰蛋白酶与乙酐在约pH6.7下反应而制得。优选采用的胰蛋白酶是牛或猪的胰蛋白酶，若需改进，最好通过乙酰化改进，最佳胰蛋白酶是乙酰化牛胰蛋白酶。从HPI制备脱(64，65)HPI的第二重要参数是温度。美国专利No.4，569，792报导HPI的典型消化温度约为或高于室温。业已发现，以高产量从HPI制备脱(64，65)HPI过程中，反应温度是重要的，优选温度约为0℃至10℃，最好偏于此范围下端，即约0℃至5℃。进行消化的第三重要参数是pH值，如美国专利No.4，569，792所述pH约为7至7.5。业已发现，为控制HPI消化而形成脱(64，65)HPI，pH值应较高，即约8至10，最佳pH约8.5至9.5。虽然为控制pH，通常采用缓冲介质，但已进一步发现，在脱(64，65)HPI的最佳制备中，不仅缓冲液保持所需pH的能力是重要的，而且它的同一性也是重要的。任一种宽范围缓冲液均可用于HPI消化，但是，其中两种缓冲液，碳酸氢铵和甘氨酸能极好地控制HPI消化，产生所需脱(64，65)HPI。在这两种缓冲液中，尤以碳酸氢铵为佳。如上所述，本发明不需要采用上述全部参数相互结合，而只需要一种。但是，将这些参数结合使用能使所得结果优于采用1种或几种(少于全部参数)所得结果。由本发明方法制得的化合物脱(64，65)HPI显示的类胰岛素抗糖尿病作用显著大于公认的人胰岛素原[参见Peavey等人J.Biol.Chem.260，13989-13994(1985年)]。由于脱(64，65)HPI具有类胰岛素活性，因而可用于治疗糖尿病，例如，它可用于各种药用组合物和制备剂，可以按各种常规方法给药，例如肌内、静脉内、皮下和腹膜内给药。关于脱(64，65)HPI给药，适于注射的用药形式包括无菌水溶液或悬浮液，以及加入无菌粉末重新制成无菌可注射溶液或悬浮液。无菌注射液的制备可按需要，将脱(64，65)HPI加入计算量的适当溶剂，可以单独加入，也可与各种其它成分一起加入。下述实施例说明本发明方法，但不限制本发明范围。实施例室温下，将人胰岛素原[5gm;由大肠杆菌(E.coli)通过重组体DNA技术制得]溶解于165ml 0.05M碳酸氢铵缓冲液中，pH为9，在冰浴中冷却，加羧肽酶B(585μl，8.55mg/ml水)，接着加入乙酰化牛胰蛋白酶(933μl，0.3mg/ml水)。所得酶∶底物＝1∶1000(重量)(羧肽酶B);1∶18，000(乙酰化牛胰蛋白酶)。该溶液在冰浴中缓缓搅拌。29小时后，加入21ml 1N HCl(最终pH＝2.7)停止该反应，将全部清晰的溶液泵送到5.5×30cm C-18 Vydac高压液体色谱柱(HPLC)上，用水洗涤后，用20-38%乙腈的0.5%三氟乙酸(TFA)缓冲液以8ml/min梯度洗脱蛋白质32小时，洗脱液通过276nm光密度监测，其它馏分通过HPLC(C-8 Ultrasphere柱)分析检测，用乙腈的0.1M单碱式磷酸钠(pH2.2)缓冲液洗脱，汇集含中等纯度脱(64，65)胰岛素原的适当馏分，冻干得到2.0gm物料。将所得物料溶解于200ml 1M乙酸中，取其一半溶液置于两个5×200cm G 50-SF Sephadex柱(于5℃下用1M乙酸平衡)中，该柱在5℃下，以1M乙酸自流运行，收集洗脱液馏分，通过在276nm光密度和HPLC分析检测。汇集适当的馏分，冻干得到1.56gm产物，HPLC纯度为98%。通过下述方法鉴定所得产物的结构为脱(64，65)-人胰岛素原氨基酸成分、N-末端顺序分析，快速原子轰击(FAB)质谱法和HPLC用可靠标准的共洗脱。下表给出用上述实施例所述方法得到的结果分析。如表所述改进的条件，证明了本发明方法的优点，所形成的脱(64，65)HPI与不希望的副产品脱(31，32)HPI的量说明这些优点。表通过胰蛋白酶/羧肽酶B消化HPI形成的脱(64，65)HPI与脱(31，32)HPI的比胰蛋白酶 温度℃ 缓冲液 pH 脱(64，65)HPI脱(31，32)HPI牛122 Tris27.5 0.3猪 5 Tris 8.5 2.2猪 37 Tris 8.5 0.7猪 2 Tris 6 1.0猪 2 Tris 6.6 1.8猪 2 Tris 7.6 2.2猪 2 Tris 8.3 2.7猪 2 Tris 9 3.1;2.9牛 2 Tris 9 1.3乙酰化牛 2 Tris 9 4.5猪 5 Tris 10 2.5猪 5 碳酸氢铵 10 3.5猪 5 甘氨酸 10 3.3猪 5 磷酸盐 10 2.4乙酰化牛 5 碳酸氢铵 8 10.8乙酰化牛 5 碳酸氢铵 9 20.8乙酰化牛 5 碳酸氢铵 10 14.3乙酰化牛 5 碳酸氢铵 11 0.11.参见Given等人的J.Clin.Invest 76，1398-1405页(19855年)。2.Tris＝三(羟甲基)氨基甲烷。权利要求1.在胰蛋白酶和羧酶肽酶B存在下，消化人胰岛素原制备脱(64，65)-人胰岛素原的方法，该方法包括在下述一种或几种条件下进行消化，所述条件为a)应用烷化或酰化胰蛋白酶；b)温度为℃至10℃；c)pH为8至10；d)应用选自碳酸氢铵和甘氨酸的缓冲液。2.如权利要求1的方法，其中所采用的胰蛋白酶是烷化或酰化胰蛋白酶。3.如权利要求2的方法，其中所述胰蛋白酶选自乙酰胰蛋白酶、三氯乙酰胰蛋白酶、氯乙酰胰蛋白酶、三氟乙酰胰蛋白酶、甲酰胰蛋白酶或丙酰胰蛋白酶。4.如权利要求3的方法，其中胰蛋白酶是乙酰牛胰蛋白酶。5.如权利要求1的方法，其中所述消化是在温度0℃至10℃或0℃至5℃下进行的。6.如权利要求1的方法，其中所述消化是在pH值为8至10下进行的。7.如权利要求6的方法，其中所述消化是在pH为8.5至9.5下进行的。8.如权利要求1的方法，其中所述消化是在选自碳酸氢铵和甘氨酸的缓冲液存在下进行的。9.如权利要求1的方法，其中所述消化在下述条件下实施存在烷化或酰化胰蛋白酶和选自碳酸氢铵、甘氨酸的缓冲液，温度为0℃至10℃，pH为8至10。10.如权利要求1的方法，其中所述消化在下述条件下实施存在乙酰牛胰蛋白酶和碳酸氢铵，温度为0℃至5℃，pH为8.5至9.5。全文摘要本文介绍从人胰岛素原制备脱(64，65)-人胰岛素原的方法，即，人胰岛素原与胰蛋白酶和羧肽酶B反应而制得。该方法的实施通过采用下述参数之任一项或全部a)应用烷化或酰化胰蛋白酶；b)温度约为0℃至10℃；c)pH约为8至10；d)应用选自碳酸氨铵和甘氨酸的缓冲液。文档编号C07K14/62GK1052332SQ90109919公开日1991年6月19日 申请日期1990年12月6日 优先权日1989年12月7日发明者詹姆斯·阿瑟·霍夫曼 申请人:伊莱利利公司