从神农香菊中分离提取芹菜素、刺槐素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法

专利名称：从神农香菊中分离提取芹菜素、刺槐素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法技术领域：本发明属于一种从天然植物中提取化学物质的方法，具体涉及到从天然植物神农 香菊分离得到芹菜素、刺槐素-7-0-3 -D-葡萄糖苷、芹菜素-7-0-3 -D-葡萄糖苷的方法。背景技术：神农香菊 Dendranthema indicum(L. )Des Monl. var aromaticum Q. H. Liuet S. F. Zhang.系菊科菊属(Dendranthema)的一个新变种，为神农架特有植物，产于湖北省神 农架林区，分布于海拔1200米以上的向阳开阔的山坡、路旁、岩石缝、灌丛边的空旷地中， 全株具有特殊的浓郁香气，民间以其花、叶阴干作香囊。鄂西山区将神农香菊用于防治感 冒、头痛、菌痢、肠炎、便秘、冠心病和高血压等疾病，神农香菊还具有杀菌消炎、平肝明目、 散风降压的功效。它可用来提取精油或浸膏，用于医药、饮料、香烟及化妆品等方面。研究 表明神农香菊疏风、清热、明目、解毒功效的主要活性成分为黄酮类化合物。但是目前关于 神农香菊的化学物质基础研究较少，现有的对神农香菊化学成分的相关报道中，尚未有关 于发现芹菜素、刺槐素-7-0- 0 -D-葡萄糖苷、芹菜素-7-0- 0 -D-葡萄糖苷的报道。现有的 关于菊科植物化学成分芹菜素、刺槐素-7-0- 3 -D-葡萄糖苷、芹菜素-7-0- 3 -D-葡萄糖苷 的分离，尤其神农香菊化学成分的分离方法多采用反复硅胶洗脱之后，再采用其他类型的 昂贵的固定相且消耗大量有机试剂的柱色谱分离得到化合物，此方法对环境污染较大。如 杨彦松等对洋甘菊中黄酮类活性成分进行分离纯化和结构确定的研究中是经过聚酰胺反 复柱色谱进行分离、纯化得到芹菜素-7-0-0-D-葡萄糖苷的，其方法分离周期长、消耗试 剂大、成本高且对环境污染大。顾瑶华等采用反复硅胶柱层析法从亳菊中分离得到芹菜素、 芹菜素-7-0-3 -D-葡萄糖苷，其方法分离周期长、所得产品纯度低、消耗试剂大、成本高且 对环境污染大。发明内容针对现有技术的上述不足，本发明要解决的技术问题是提供一种从神农香菊中分 离提取芹菜素、刺槐素-7-0- 3 -D-葡萄糖苷、芹菜素-7-0- 3 -D-葡萄糖苷的方法，它具有 分离效果好、时间短、得到产品纯度高、消耗有机试剂少、对环境污染小等优点。本发明的技术方案是从神农香菊中分离提取芹菜素、刺槐素-7-0-0 -D-葡萄糖 苷、芹菜素-7-0-3 -D-葡萄糖苷的方法按以下步骤依次进行[1]制备浸膏(1)将神农香菊干花，粉碎过20目筛；(2)将神农香菊干花粉以70%乙醇浸泡12小时后，用70%乙醇渗漉提取，收集渗 漉液；(3)收集渗漉液至原药材量的10倍，再采用水浴加热或旋转蒸发仪将渗漉液进行 浓缩，浓缩得神农香菊浸膏；[2]萃取在神农香菊浸膏中加入蒸馏水，使神农香菊浸膏在水中呈悬浮状态，依次用石油 醚、氯仿、乙酸乙酯对神农香菊浸膏进行萃取，得到3个提取部位，保留乙酸乙酯提取部位；[3]分离提取(1)将上述的乙酸乙酯提取部位进行常压或减压200-300目的硅胶层析柱进行层 析，以石油醚-乙酸乙酯、氯仿_甲醇系统反复洗脱层析柱，以薄层析方法检测流份，显色后 收集流份；(2)将上述流份经半制备高效液相色谱仪分离，分离后得到3种流份，将3种 流份分别进行浓缩、干燥及重结晶，分别得到化合物刺槐素-7-0-3-D-葡萄糖苷、芹菜 素-7-0-0 -D-葡萄糖苷、芹菜素。本发明的方法采用硅胶柱层析之后直接采用半制备高效液相色谱仪分离得到以 上三化合物，本方法分离效果好、时间短、得到产品纯度高、消耗有机试剂少、对环境污染具体实施例方式下面对本发明的有关技术问题作进一步详细的描述。本方法与同类文献报道最大的改进之处就是采用硅胶柱层析之后直接采用半制 备高效液相色谱仪分离得到以上三化合物。其优点是方法简单、分离效果好，时间短、得到 产品纯度高、大大减少有机试剂的消耗，且环保。现有技术中关于采用常压和减压硅胶柱层 析及半制备高效液相色谱法从菊科植物中分离得到芹菜素、刺槐素-7-0-3 -D-葡萄糖苷、 芹菜素-7-0-3 -D-葡萄糖苷的报道未见。尤其没有关于采用常压和减压硅胶柱层析及半 制备高效液相色谱法从神农香菊植物中分离得到芹菜素、刺槐素-7-0-3 -D-葡萄糖苷、芹 菜素-7-0-0 -D-葡萄糖苷的报道。申请人:采用半制备高效液相色谱的条件为流动相甲醇水(63 37)，流速 2. 5mL/min，柱温25°C，进样量0. 5mL。申请人对所提取的3种化合物进行了相关的鉴定， 对鉴定情况作如下简要说明。(1)刺槐素-7-0-3 -D-葡萄糖苷淡黄色结晶，mp 260 262°C。盐酸-镁粉和Molish反应为阳性。酸水解检出葡 萄糖。提示为黄酮苷类化合物；在锆盐-枸橼酸显色反应中，加入二氯氧锆(ZrOCl2)后显 亮黄色，再加入枸橼酸黄色消失，因此分子中含有C5-0H存在，但没有游离的C3-0H存在。'H-NMR [600MHz, DMS0_d6] 12. 93 (1H, s，5_0H)，8. 08 (2H, d, J = 7. 8Hz, H_2' and 6' )，7. 15(2H，d，J = 7. 8Hz，H-3' and 5' )，6. 91 (1H，s，H_3)，6. 89 (1H，d，J = 2. 1Hz， H-8), 6. 49 (1H, d, J = 2. 1Hz, H_6)，5. 13 5. 49 (4H, m，糖上 OH)，5. 10 (1H, d, J = 7. 2Hz, H-葡萄糖端基质子为 3-构型)，3.27-3.90(5扎111，糖上11)，3.79(311，8，4' _0CH3)。13C-WR [600MHz，DMS0-d6] :182. 7 (C_4)，163. 7 (C_7)，164. 5 (C_2)，161. 8 (C_4')， 157. 6(C-9)，163. 1(C-5),128. 9(C_2 ' and 6 ' )，123. 0(C_l),115. 1(C_3 ' and 5 ')， 106. 6 (C-10)，100. 1 (C-6)，95. 5 (C_8)，55. 9 (C_0CH3)。根据以上数据并对照文献报道，鉴定为刺槐素-7-0- 0 -D-葡萄糖苷(acacetin-7 -0-^ -D-glucopyranoside) 其化学结构如下 (2)芹菜素-7-0- 0 -D-葡萄糖苷黄色粉末(MeOH)，mp 226 228 °C，盐酸-镁粉反应和Molish反应均为阳性。 酸水解检出葡萄糖，提示为黄酮苷类化合物；在锆盐-枸橼酸显色反应中，加入二氯氧锆 (ZrOCl2)后显亮黄色，再加入枸橼酸黄色消失，因此分子中含有C5-0H存在，但没有游离的 C3-OH存在。'H-NMR[600MHz, DMS0_d6] 7. 78 (2H, d, J = 9. 0Hz, H_2' and 6' ) ,6. 83 (2H, d, J = 9.0Hz，H-3' and 5' ),6. 71 (1H, s, H_3)，6. 39 (1H，d, J = 1.8，H_8)，6. 39 (1H，d, J =1.8泡，11-6^环7位被糖基取代)，4.97(111，(1，=6. 6Hz，H-葡萄糖端基质子为构 型)，3. 39 3. 84(5H, m)。13C-NMR [600MHz，DMSO-dJ 184. 0 (C_4), 164. 8 (C_7), 166. 6 (C_2), 162. 8 (C_4')， 158. 9(C-9)，162. 9(C_5),129. 6(C_2 ‘，C_6 ' )，123. 1(C_l ' )，117. 2(C_3 '，C_5 ')， 107. 1(C-10)，104.5 (C-3)，101.2 (C-6)，96.2 (C-8)，78.6 (C-5 “ )，77.9(C_3 “)， 74. 8 (C-2" )，71.3(C-4〃)，62.5(C_6〃)。以上数据与文献报道的芹菜素-7-0- 0 -D-葡萄糖苷基本一致，故鉴定化合物为 芹菜素-7-0-0 -D-葡萄糖苷(apigenin-7-0-0 -D-glucopyranoside)。其化学结构如下 (3)芹菜素黄色粉末(MeOH)，mp 345 347°C，溶于甲醇、乙醇、稀碱溶液。盐酸-镁粉反应 为阳性。Molish反应为阴性，提示可能为黄酮苷元。EI-MS m/z :270，242，152，128，121，118。iH-WR^OOMHzJMSO-cQ S :7. 71(2H，d，J = 7. 8，H-2' and H-6' )，6.83(2H，d， J = 7. 8Hz, H-3' and H_5' ) ,6. 42 (1H, s, H_3)，6. 31 (1H，d, J = 1. 8Hz，H_8)，6. 10 (1H, d, J = 1. 8Hz, H-6)。13CNMR(600MHz, DMS0_d6) 8 181. 6 (C_4)，165. 9 (C-2)，163. 6 (C_7)， 161. 2(C-4 ' )，161. 4 (C-9)，157. 6 (C-5)，128. 5 (C-2 ' and 6 ' )，121.3(C_1 ')， 116. 1 (C-3' and 5' )，103. 2 (C-3)，102. 8 (C-10)，99. 3 (C-6)，94. 3 (C-8)。以上光谱数据和芹菜素相关文献报道数据基本一致，故推断化合物为芹菜素 (apigenin)。其化学结构如下 本发明采用硅胶柱层析之后直接采用分离效果好、时间短、所得产品纯度 高、消耗有机试剂少的半制备高效液相色谱首次从神农香菊中分离得到芹菜素、刺槐 素-7-0-^-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-0-0 -D-葡萄糖苷。本方法与同类文献报道最大的改 进之处就是采用硅胶柱层析之后直接采用半制备高效液相色谱仪分离得到以上三化合物。 且采用常压和减压硅胶柱层析及半制备高效液相色谱法从菊科植物中分离得到芹菜素、刺 槐素-7-0- 0 -D-葡萄糖苷、芹菜素-7-0- 0 -D-葡萄糖苷的报道未见。提取工艺简单、分离 效果好，时间短、得到产品纯度高、有机试剂消耗少、低成本，且环保，为研究神农香菊的化 学物质基础提供了 一定的参考依据。实施例1神农香菊干花，粉碎过20目筛，取3公斤，以70%乙醇浸泡12小时后渗漉提取， 收集渗漉液至原药材量的10倍，回收溶剂得浸膏，用适量蒸馏水将浸膏悬浮，依次用石油 醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到三个提取部位，然后对乙酸乙酯部位进行常压和减压200-300 目的硅胶柱层析，以石油醚_乙酸乙酯、氯仿_甲醇系统反复洗脱，以TLC为检出手段，收 集流份，经半制备高效液相色谱仪分离，浓缩、干燥及重结晶。色谱条件流动相甲醇7jC (63 37)，流速2. 5mL/min,柱温25°C，进样量0. 5mL。鉴定淡黄色结晶，mp 260 262°C。盐酸-镁粉和Molish反应为阳性。酸水解 检出葡萄糖。提示为黄酮苷类化合物；在锆盐-枸橼酸显色反应中，加入二氯氧锆(&0C12) 后显亮黄色，再加入枸橼酸黄色消失，因此分子中含有C5-oh存在，但没有游离的C3-OH存在。'H-NMR[600MHz, DMS0_d6] 12. 93 (1H, s，5_0H)，8. 08 (2H, d, J = 7. 8Hz, H_2' and 6' )，7. 15(2H，d，J = 7. 8Hz，H-3' and 5' )，6. 91 (1H，s，H_3)，6. 89 (1H，d，J = 2. 1Hz， H-8)，6. 49 (1H, d, J = 2. 1Hz, H_6)，5. 13 5. 49 (4H, m，糖上 OH)，5. 10 (1H, d, J = 7. 2Hz, H-葡萄糖端基质子为 3-构型)，3.27-3.90(5扎111，糖上11)，3.79(311，8，4' _0CH3)。13C-WR [600MHz，DMS0-d6] :182. 7 (C_4)，163. 7 (C_7)，164. 5 (C_2)，161. 8 (C_4')， 157. 6(C-9)，163. 1(C-5),128. 9(C_2 ' and 6 ' )，123. 0(C_l),115. 1(C_3 ' and 5 ')， 106. 6 (C-10)，100. 1 (C-6)，95. 5 (C_8)，55. 9 (C_0CH3)。根据以上数据并对照文献报道，鉴定为刺槐素-7-0- 0 -D-葡萄糖苷。实施例2神农香菊干花，粉碎过20目筛，取3公斤，以70%乙醇浸泡12小时后渗漉提取， 收集渗漉液至原药材量的10倍，回收溶剂得浸膏，用适量蒸馏水将浸膏悬浮，依次用石油 醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，得到三个提取部位，然后对乙酸乙酯部位进行常压和减压硅胶柱 层析，以石油醚_乙酸乙酯、氯仿_甲醇系统反复洗脱，以TLC为检出手段，收集流份，经半 制备高效液相色谱仪分离，浓缩、干燥及重结晶。色谱条件流动相甲醇水(63 37)， 流速2. 5mL/min，柱温25°C，进样量0. 5mL。鉴定黄色粉末(MeOH)，mp 226 228°C，盐酸-镁粉反应和Molish反应均为阳性。酸水解检出葡萄糖，提示为黄酮苷类化合物；在锆盐-枸橼酸显色反应中，加入二氯氧 锆(ZrOCl2)后显亮黄色，再加入枸橼酸黄色消失，因此分子中含有C5-0H存在，但没有游离 的(3-011存在。'H-NMR[600MHz, DMS0_d6] 7. 78 (2H, d, J = 9. 0Hz, H_2' and 6' ) ,6. 83 (2H, d, J = 9.0Hz，H-3' and 5' ),6. 71 (1H, s, H_3)，6. 39 (1H，d, J = 1.8，H_8)，6. 39 (1H，d, J =1.8泡，11-6^环7位被糖基取代)，4.97(111，(1，=6. 6Hz，H-葡萄糖端基质子为构 型)，3. 39 3. 84(5H, m)。13C-NMR [600MHz，DMSO-dJ 184. 0 (C_4), 164. 8 (C_7), 166. 6 (C_2), 162. 8 (C_4')， 158. 9(C-9)，162. 9(C_5),129. 6(C_2 ‘，C_6 ' )，123. 1(C_l ' )，117. 2(C_3 '，C_5 ')， 107. 1(C-10)，104.5 (C-3)，101.2 (C-6)，96.2 (C-8)，78.6 (C-5 “ )，77.9(C_3 “)， 74. 8 (C-2" )，71.3(C-4〃)，62.5(C_6〃)。以上数据与文献报道的芹菜素-7-0- 0 -D-葡萄糖苷基本一致，鉴定化合物为芹 菜素-7-0-0-D-葡萄糖苷。实施例3神农香菊干花，粉碎过20目筛，取3公斤，以70%乙醇浸泡12小时后渗漉提取，收 集渗漉液至原药材量的10倍，回收溶剂得浸膏，用适量蒸馏水将浸膏悬浮，依次用石油醚、 氯仿、乙酸乙酯萃取，得到三个提取部位，然后对乙酸乙酯部位进行常压和减压200-300目 的硅胶柱层析，以石油醚_乙酸乙酯、氯仿_甲醇系统反复洗脱，以TLC为检出手段，收集流 份，经半制备高效液相色谱分离，收集流份，流份经浓缩、干燥及重结晶。色谱条件流动相 甲醇水(63 37)，流速2. 5mL/min，柱温25°C，进样量0. 5mL。鉴定黄色粉末(MeOH)，mp 345 347°C，溶于甲醇、乙醇、稀碱溶液。盐酸-镁粉 反应为阳性。Molish反应为阴性，提示可能为黄酮苷元。EI-MS m/z :270，242，152，128，121，118。iH-WR^OOMHzJMSO-cQ S :7. 71(2H，d，J = 7. 8，H-2' and H-6' )，6.83(2H，d， J = 7. 8Hz, H-3' and H_5' ) ,6. 42 (1H, s, H_3)，6. 31 (1H，d, J = 1. 8Hz，H_8)，6. 10 (1H, d, J = 1. 8Hz, H-6)。13CNMR(600MHz, DMS0_d6) 8 181. 6 (C_4)，165. 9 (C-2)，163. 6 (C_7)， 161. 2(C-4 ' )，161. 4 (C-9)，157. 6 (C-5)，128. 5 (C-2 ' and 6 ' )，121.3(C_1 ')， 116. 1 (C-3' and 5' )，103. 2 (C-3)，102. 8 (C-10)，99. 3 (C-6)，94. 3 (C-8)。以上光谱数据和芹菜素相关文献报道数据基本一致，鉴定化合物为芹菜素。权利要求一种从神农香菊中分离提取芹菜素、刺槐素 7 O β D 葡萄糖苷、芹菜素 7 O β D 葡萄糖苷的方法，其特征在于所述的分离提取方法按以下步骤依次进行[1]制备浸膏(1)将神农香菊干花，粉碎过20目筛；(2)将神农香菊干花粉以70％乙醇浸泡12小时后，用70％乙醇渗漉提取，收集渗漉液；(3)收集渗漉液至原药材量的10倍，再采用水浴加热或旋转蒸发仪将渗漉液进行浓缩，浓缩得神农香菊浸膏；[2]萃取在神农香菊浸膏中加入蒸馏水，使神农香菊浸膏在水中呈悬浮状态，依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯对神农香菊浸膏进行萃取，得到3个提取部位，保留乙酸乙酯提取部位；[3]分离提取(1)将上述的乙酸乙酯提取部位进行常压或减压200 300目的硅胶层析柱进行层析，以石油醚 乙酸乙酯、氯仿 甲醇系统反复洗脱层析柱，以薄层析方法检测流份，显色后收集流份；(2)将上述流份经半制备高效液相色谱仪分离，分离后得到3种流份，将3种流份分别进行浓缩、干燥及重结晶，分别得到化合物刺槐素 7 O β D 葡萄糖苷、芹菜素 7 O β D 葡萄糖苷、芹菜素。全文摘要本发明公开了一种从神农香菊中分离提取芹菜素、刺槐素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷的方法，属于一种从天然植物中提取化学物质的方法。方法按以下步骤依次进行[1]制备浸膏；[2]萃取依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯对神农香菊浸膏进行萃取；[3]分离提取(1)将乙酸乙酯提取部位进行常压和减压硅胶柱层析；(2)将上述流份经半制备高效液相色谱仪分离，得到化合物刺槐素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖苷、芹菜素。本发明的方法采用硅胶柱层析之后直接采用半制备高效液相色谱仪分离得到以上三化合物，分离效果好、时间短、产品纯度高、对环境污染小。文档编号C07D311/40GK101891727SQ200910062199公开日2010年11月24日 申请日期2009年5月22日 优先权日2009年5月22日发明者卢金清, 李琳, 郭国宁 申请人:湖北中烟工业有限责任公司