人体基因组dna样本的制备方法

专利名称：人体基因组dna样本的制备方法技术领域：本发明涉及基因样本的制备方法，特别是人体基因组样本的制备方法。背景技术： 人体基因组是指人体细胞内全部的遗传物质DNA。基因组DNA通过4种核苷酸的组合排列，蕴藏人体全部的遗传信息，经表达呈现人体全部的生命特征。保存人体基因组DNA样本即保存人体的全部生命信息。近代分子生物学技术的进步，已能在体外对基因组DNA的各种基因进行检测分析和克隆，用于疾病的基因诊断、个体识别、亲权鉴定、基因家谱的构建及遗传疾病的调查等。目前，某些发达国家如美国、日本等已成立许多专业公司，面向普通人群，开展个人基因样本保存的服务，保存的基因组DNA可以长期维持其理化性质及生物学活性的稳定性。有的从商业角度出发，将某个人的基因组DNA封装在首饰上，随身佩带，作为一种具有特殊意义的纪念物。但到目前为止，国外开展基因样本保存服务的公司，为保持基因结构的完整性和性质的稳定性，都将分离获得的基因组DNA样本存贮在超低温条件下，费用甚为昂贵，个人难以实施。发明内容本发明要解决已有技术中人体基因组样本制备和保存所存在的实施条件苛刻、费用昂贵、个人难以实现的问题，为此而提供本发明的人体基因组DNA样本的制备方法，本方法操作比较简单，费用省，所制样本保存简便且能在室温下长期保存。为解决上述问题，本发明采用的技术方案包括取人体组织细胞样品，此样品经细胞裂解和RNA水解后，去除水解液中的蛋白质，获取含DNA的溶液，其特征是在所述含DNA的溶液中加入沉淀剂使DNA呈絮状沉淀的同时加入微孔玻璃颗粒并振摇，使沉淀的DNA吸附于微孔玻璃颗粒，经液-固分离后制得包含DNA的粒状样本——人体基因组DNA样本。所述的微孔玻璃颗粒为如下颗粒I、颗粒II或颗粒III之一种或数种，微孔玻璃颗粒的直径为颗粒I43微米～74微米，颗粒II74微米～125微米，颗粒III125微米～177微米，微孔玻璃颗粒的孔径为50纳米～100纳米。为使所述的样本得以去杂纯化，可将所述液-固分离后得到的包含DNA的粒状样本经洗涤后干燥。洗涤所用洗涤液可以是浓度70％(W/W)的乙醇-水溶液或丙酮，干燥可以是室温空气中自然干燥或低温真空干燥。可以将干燥后呈白色的颗粒状样本封装于去氧充氮的玻璃安瓿，以利于长期保存。在微孔玻璃颗粒上吸附有DNA的本发明的人体基因组DNA样本，可用蒸馏水及TE缓冲液解析，得到溶有DNA的液体，该液体可直接用于基因分析。本发明中的人体组织细胞样品为何种组织无所限定，可以是血液样品，也可以是口腔粘膜上皮细胞样品或毛发样品，还可以是其他样品。此样品作细胞裂解所用裂解液是本领域普通技术人员所能知晓的。细胞裂解后液体中含有DNA(脱氧核糖核酸)、RNA(核糖核酸)和蛋白质，经加入核糖核酸酶A溶液，使RNA水解溶于液体，再加入蛋白质沉淀剂(有内含醋酸铵的)使蛋白质沉淀后除去之。RNA水解及除去蛋白质后的溶液含DNA，加入沉淀剂，如异丙醇、无水乙醇，使DNA呈絮状沉淀。适用于本发明的所述的微孔玻璃颗粒，可采用浙江省杭州市绿得力化工有限公司生产和销售的微孔玻璃颗粒。本发明由于在使DNA呈絮状沉淀的同时加入微孔玻璃颗粒，使DNA吸附于微孔玻璃颗粒，经液-固分离后制得包含DNA的粒状样本，故本发明制作简便，费用省，所制样本保存方便，并容易对样本作DNA分析。微孔玻璃颗粒主要成分为二氧化硅，具有极高的物理化学稳定性，不被酸、碱及有机溶剂溶解和改性；这种颗粒具有多孔网状结构，有很大的吸附界面，能高效吸附DNA。具体实施例方式实施例1 用人体血液制备基因组DNA样本1、人体血液样品采集和保存以乙二胺四乙酸(EDTA)做抗凝剂，采集全血500μl。此血样在4℃可保存5天，如在-80℃冰冻保存，至少可维持2年而不变质。2、裂解细胞于300μl全血中加入红细胞裂解液(内含氯化铵、乙二胺四乙酸、碳酸氢钠)900μl，使红细胞裂解。经离心沉淀，倾弃上清液，去除血红蛋白，得白细胞沉淀。在沉淀中加入细胞裂解液(内含三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸、十二烷基硫酸钠)300μl，裂解白细胞。3、核糖核酸酶处理在细胞裂解物中加入核糖核酸酶A溶液(4mg/ml)1.5μl，经混匀，37℃水浴保温，使核糖核酸(RNA)降解，溶解于反应液中。4、沉淀蛋白质于上述反应液中加入蛋白质沉淀剂(内含醋酸铵)100μl，充分摇匀，使蛋白质沉淀，经离心，去除沉淀的蛋白质，留取含DNA的上清液。5、沉淀并吸附DNA在含DNA的上清液中加入100％异丙醇(或冷冻无水乙醇)300μl，结果DNA呈絮状沉淀，同时加入微孔玻璃颗粒3mg，振摇，使沉淀的DNA吸附于微孔玻璃颗粒。再经离心，倾去上清液(内含RNA降解物及残留的蛋白质)，留取的沉淀即为包含DNA的粒状物(DNA紧密吸附于微孔玻璃颗粒)。此粒状物用冷冻的70％乙醇(或丙酮)500μl洗涤两次，以去除杂质。最后得到吸附有DNA的微孔玻璃颗粒，置于室温空气中自然干燥或低温真空干燥，目的物呈现白色干燥的细颗粒固型物，即为制得的人体基因组DNA纯化样本，在安瓿拉丝灌封机上去氧充氮，封装于玻璃安瓿中。实施例2 用人体口腔粘膜上皮细胞制备基因组DNA样本用无菌专用尼龙刷在口腔内壁刮擦数次，取出浸没于500μl细胞裂解液中，并不时搅动；同时加入蛋白酶K溶液(20mg/ml)1.5μl，混匀后于55℃水浴中保温过夜，使细胞充分裂解，释出DNA，后续操作与上例步骤3、4、5相同。实施例3 用人体头发毛囊制备基因组DNA样本用清洁不锈钢镊子拔取头发3根，用蒸馏水清洗头发及根部毛囊的附着物，然后从头发根部剪取1cm，将发根毛囊部分浸入含有400μl细胞裂解液的离心管中，再加入蛋白酶K溶液2μl，56℃水浴保温过夜。次日离心去除毛发及其它杂质后，按例1步骤3、4、5程序操作获得DNA纯化样本。权利要求1.人体基因组DNA样本的制备方法，包括取人体组织细胞样品，此样品经细胞裂解和RNA水解后，去除水解液中的蛋白质，获取含DNA的溶液，其特征是在所述含DNA的溶液中加入沉淀剂使DNA呈絮状沉淀的同时加入微孔玻璃颗粒并振摇，使沉淀的DNA吸附于微孔玻璃颗粒，经液-固分离后制得包含DNA的粒状样本——人体基因组DNA样本。2.如权利要求1所述的制备方法，其特征是所述的微孔玻璃颗粒为如下颗粒I、颗粒II或颗粒III之一种或数种，微孔玻璃颗粒的直径为颗粒I43微米～74微米，颗粒II74微米～125微米，颗粒III125微米～177微米，微孔玻璃颗粒的孔径为50纳米～100纳米。3.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是所述液-固分离后得到的包含DNA的粒状样本经洗涤、干燥。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征是洗涤所用洗涤液为乙醇-水溶液或丙酮，干燥为室温空气中自然干燥或低温真空干燥。5.如权利要求1或2所述的制备方法，其特征是所述的沉淀剂为异丙醇或无水乙醇。6.如权利要求4所述的制备方法，其特征是所述干燥后的样本封装于去氧充氮的玻璃安瓿。全文摘要操作方便，费用省，保存容易的人体基因组DNA样本的制备方法，取人体组织细胞样品，此样品经细胞裂解和RNA水解后，去除水解液中的蛋白质，获取含DNA的溶液，在所述含DNA的溶液中加入沉淀剂使DNA呈絮状沉淀的同时加入微孔玻璃颗粒并振摇，使沉淀的DNA吸附于微孔玻璃颗粒，经液－固分离后制得包含DNA的粒状样本——人体基因组DNA样本。本发明适用于人体基组DNA样本的制备、保存以用于基因分析。文档编号C07H21/00GK1537948SQ03108990公开日2004年10月20日 申请日期2003年4月16日 优先权日2003年4月16日发明者陈枢青, 厉朝龙, 陈亦胜 申请人:陈枢青 陈亦胜 厉朝龙