胰岛素类似物的制作方法

专利名称：胰岛素类似物的制作方法技术领域：本发明是属于人药的领域，特别是涉及糖尿病的治疗。更具体地说，本发明涉及人胰岛素分子的类似物，使用这些类似物的方法以及含有这些胰岛素类似物的药物组合物。糖尿病是一种代谢紊乱，其特征为机体组织不能以正常速率氧化碳水化合物。缺乏胰岛素是糖尿病症状的最重要因素。在最近的70年期间，患有糖尿病的人们通过接受控制量的胰岛素而获得很大益处。直至80年代初期，治疗糖尿病所使用的胰岛素是从动物胰、通常是牛和猪的胰中分离的。由于引用了重组DNA技术，生产大量的天然人胰岛素以及天然和非天然存在的人胰岛素类似物已成为可能。与天然人胰岛素相比，这些胰岛素类似物显示出不同的物理和化学特性。天然人胰岛素在其B链的26位上含有酪氨酸残基。用丙氨酸残基代替该酪氨酸残基后产生了一种类似物，Ala(B26)人胰岛素，该类似物在溶液中显示的自缔合趋势比天然人胰岛素更低。该Ala(B26)人胰岛素类似物也比正常人胰岛素更稳定并具有更快的作用速率。还可以用甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸和脯氨酸代替B26位残基。本发明涉及通过将天然人胰岛素B链上的第26位氨基酸由酪氨酸改变为丙氨酸、甘氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸或脯氨酸而得到的已修饰的人胰岛素的类似物。还可以改变该分子的天然人胰岛素A链的第21位以及天然人胰岛素B链的第1和3两位点。所说胰岛素类似物更稳定并且更不易于二聚体化或自缔结为更高分子量的形状，因此相比较而言该类似物具有更快速的作用活性，同时保留了天然人胰岛素的生物活性。还公开并要求保护一种通过给需要治疗的患者施用有效量的要求保护的类似物而治疗高血糖症的方法。进一步公开并要求保护含有结合了一种或多种可药用赋形剂的有效量的本发明胰岛素类似物的药物组合物。为了达到本发明目的，如本文所公开及要求保护的，将下述术语及缩写进行如下定义。Ala(B26)HI-一种人胰岛素类似物，其中在天然人胰岛素B链的第26位上的酪氨酸残基已被改变为丙氨酸残基。BHI-生物合成的人胰岛素。交联-在半胱氨酸残基之间形成二硫键。正确交联的天然人胰岛素或胰岛素类似物含有三个二硫桥键。第一个二硫桥键存在于A链的第6和11位的半胱氨酸残基之间。第二个二硫桥键将A链的第7位上的半胱氨酸与B链第7位上的半胱氨酸相连接。第三个二硫桥键将A链的第20位上的半胱氨酸与B链的第19位上的半胱氨酸相连接。Gly(B26)HI-一种人胰岛素类似物，其中在天然人胰岛素B链的第26位上的酪氨酸残基已被改变为甘氨酸残基。Ile(B26)HI-一种人胰岛素类似物，其中在天然人胰岛素B链的第26位上的酪氨酸残基已被改变为异亮氨酸残基。Leu(B26)HI-一种人胰岛素类似物，其中在天然人胰岛素B链的第26位上的酪氨酸残基已被改变为亮氨酸残基。Pro(B26)HI-一种人胰岛素类似物，其中在天然人胰岛素B链的第26位上的酪氨酸残基已被改变为脯氨酸残基。SEQ ID NO1-在序列表中列出的第一个序列，该序列是具有下列顺序的人胰岛素A链类似物Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln15 10 15Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa20其中Xaa是Asn，Asp，Glu，Gln，Ala，Gly or Ser.SEQ ID NO2-在序列表中列出的第二个序列，该序列是具有下列顺序的人胰岛素B链类似物Xaa Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu1 5 10 15Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Xaa Thr Pro Lys Thr20 25其中在1位上的Xaa是Phe或Asp，在3位上的Xaa是Asn或Asp，而在26位上的Xaa是Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Pro。Val(B26)HI-一种人胰岛素类似物，其中在天然人胰岛素B链的第26位上的酪氨酸残基已被改变为缬氨酸残基。按照37C.F.R.§1.822(b)(2)(1990)的规定，本文中使用的所有氨基酸缩写都可以为美国专利和商标局承认。本发明涉及下列通式的胰岛素类似物SEQ ID NO1 被正确地交联至SEQ ID NO2 或该类似物的可药用的盐，其中在SEQ ID NO1(胰岛素A链)的第21位上的Xaa是Asn、Asp、Glu、Gln、Ala、Gly或Ser;在SEQ ID NO2(胰岛素B链)的第1位上的Xaa是Phe或Asp;在SEQ ID NO2的第3位上的Xaa是Asn或Asp，以及在SEQ ID NO2的第26位上的Xaa是Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Pro。优选的是，在SEQ ID NO1的第21上位的Xaa是Gly、Ala、Ser或Asn。在B链(SEQ ID NO2)的第26位上的优选的氨基酸残基是Ala和Gly，而在该位点的最优选的残基是Ala。在第21位上特别优选的氨基酸是天冬酰胺。通过除去通常存在于胰岛素B链(SEQ ID NO2)的第1位上的氨基酸残基可以产生本发明的一种类似物。SEQ ID NO2的第1位上优选的氨基酸是Phe，而在SEQ ID NO2的第3位上最优选的残基是Asn。本发明的特别优选的胰岛素类似物是一种在SEQ IDNO1的第21位上的Xaa为Asn，在SEQ ID NO2的第1位上的Xaa为Phe，在SEQ ID NO2的第3位上的Xaa为Asn以及在SEQ ID NO2的第26位上的Xaa为Ala的类似物。用本领域内技术人员已知的标准生化术语，所说的特别优选的类似物是Ala(B26)人胰岛素。在含在锌或不含锌的溶液中，本发明的胰岛素类似物具有降低了的二聚化或其他的自缔合为更高分子量形式的趋势。由于在溶液中这些类似物通常是单体形式，因此一旦给药就获得快速的作用活性。如上文所介绍的，本发明包括胰岛素类似物的可药用的盐。优选的这样的盐是锌盐、钠盐、钾盐、镁盐、钴盐或这些盐的结合。本发明的胰岛素类似物可以采用各种已公认的肽合成技术制备，包括经典(溶液)方法、固相方法、半合成方法以及最近使用的重组DNA方法。关于固相技术，从一种起始的、不溶的、由树脂支撑的C-末端氨基酸依次构建氨基酸序列。关于固相方法的技术由J.Stewart等人，Solid-Phase Peptide Synthesis，Freeman and Co.San Francisco，1969公开。总的说来，在固相方法中，将对应于所需肽的C-末端的氨基酸残基的氨基酸固定到一种不溶性树脂支撑物上，然后从树脂支撑的C-末端氨基酸开始形成肽链。依次逐个导入各个氨基酸直至获得所需的氨基酸序列。另外，可以制备小肽片段并按照所需顺序导入到肽链中。得到的肽链在整个合成过程中吸附在树脂上，并且一旦完成该链就从树脂上切下肽链。借助于在C-末端部分的羧基和作为吸附位点的、存在于树脂基质上的特定的亚甲基基团之间形成的酯键，将肽链吸附到聚苯乙烯树脂上。使用本领域内已知的用于合成肽键的技术将氨基酸偶合。一种方法包括将氨基酸转变为一种衍生物，这使得羧基基团更易于与肽片段的游离N-末端氨基发生反应。例如，通过将被保护的氨基酸与氯甲酸乙基酯、氯甲酸苯基酯、氯甲酸仲丁基酯或氯甲酸异丁基酯反应而将氨基酸转变为混合的酸酐。另外，可将氨基酸转变为一种活性酯如2，4，5-三氯代苯基酯、五氯代苯基酯、对硝基苯基酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯、或由1-羟基苯并三唑形成的酯。另一种偶合方法包括使用合适的偶合剂，如N，N′-二环己基碳二亚胺(DCC)或N，N′-二异丙基碳二亚胺(DIC)。其他合适的偶合剂对本领域内熟练技术人员来说也是显而易见的。参见Schroder和Lubke，The Peptides，Academic Press，1965，Chapter Ⅲ，该文引入本文作为参考。应该认识到在偶合反应过程中必须将在肽合成中使用的各个氨基酸的α-氨基保护起来以便防止涉及活性α-氨基功能的副反应。还应该认识到某些氨基酸含有活性侧链功能基(例如，巯基、ε-氨基、β-和γ-羧基、咪唑、胍基和羟基)，并且在起始期间以及随后的偶合步骤中也必须保护这样的功能基。合适的保护基团是本领域熟知的。例如，参见Protective Groups In Organic Chemistry，M.McOmie，Editor，Plenum Press，N.Y.，1973和美国专利4，617，149，在此引入本文作为参考。在选择特定的保护基时，必须注意到某些条件。一种α-氨基保护基(1)必须使得α-氨基功能基在偶合反应中使用的条件下是惰性的，(2)在不移走侧链保护基以及不改变肽片段结构的条件下，在偶合反应后必须是容易移走的，以及(3)必须消除在偶合之前一旦活化后立即外消旋化的可能性。侧链保护基(1)在偶合反应中使用的条件下必须使得侧链功能基是惰性的，(2)在移走α-氨基保护基所使用的条件下必须是稳定的，以及(3)在所需氨基酸序列合成结束后在不改变肽链结构的反应条件下必须是容易移走的。本领域内技术人员显然知道，已知的用于肽合成的保护基与为了移走这些基团而使用的试剂的反应性是不相同的。例如，某些保护基，如三苯基甲基和2-(对联苯基)异丙氧羰基是非常不稳定的并且能在弱酸性条件下被切割。其他的保护基，如叔丁氧羰基、叔戊氧羰基、金刚烷氧羰基以及对甲氧基苄氧羰基相对稳定并且为了移走这些基团需要中等强度酸，如三氟乙酸、盐酸或三氟化硼的乙酸溶液。还有其他的保护基，如苄氧羰基、卤代苄氧羰基、对硝基苄氧羰基、环烷氧羰基以及异丙氧羰基甚至更相对稳定，并且为了移走这些基团需要更强的酸，如氟化氢，溴化氢或三氟乙酸化硼的三氟乙酸溶液。在所需的肽序列合成结束后，必须从树脂支座上切下被保护的肽，并且移走所有保护基。切割反应和移走保护基可以同时或逐步完成。如果树脂支座是氯甲基化的聚苯乙烯树酯，将肽固定到树脂上的键是在C-末端部分的游离羧基和在树脂基质上存在的许多氯甲基基团之一之间形成的酯键。本领域内技术人员将会认识到使用本领域内已知的能断裂酯键并且能穿过树脂基质的试剂可以将该固定键裂解。一种特别方便的方法是用液态的无水氟化氢。该试剂不仅从树脂上切下肽，而且还能移走所有的保护基团。因此，使用该试剂可以直接提供完全脱保护的肽。如果期望在不除去保护基团的情况下将肽切下，则可将被保护的肽-树脂进行甲醇分解以得到其C-末端羧基为甲基化的被保护的肽。然后在温和的碱性条件下水解甲基酯以得到游离的C-末端羧基。然后通过用强酸，如液态氟化氢处理而除去肽链上的保护基。进行甲醇分解的特别有用的技术是G.Moore等人，Peptides，Proc.5th Amer.Pept.Symp.，M.Goodman and J.Meienhofer，Eds.，John Wiley，N.Y.1977，pp.518-521公开的技术，其中在冠醚存在下用甲醇和氰化钾处理被保护的肽-树脂。从树脂上断割被保护肽的另一种方法是进行氨解作用或用肼处理。如果需要，将得到的C-末端酰胺或酰肼水解为游离的C-末端羧基，并且能很容易地移走保护基。还将认识到在从树脂支座上裂解下被保护的肽之前或同时，应优先移走存在于N-末端的α-氨基基团上的保护基。借助于重组DNA方法也可以制备本发明胰岛素类似物的A和B链。在其制备过程中，用执行这种合成的新的常规技术制备编码所需的A或B链的肽的核苷酸序列。这些方法通常包括制备既为所需编码序列的片段编码又为其互补序列编码的寡核苷酸。设计这些寡核苷酸以便得到该编码序列的一个片段与互补序列的二个片段相重迭并且反之亦然。将这些寡核苷酸配对并连接，最后产生所需的基团序列。将该序列插入到一个克隆载体的某一位点上，使得该序列编码的肽产物得到表达。按照Chance等人，欧洲专利公开No.0383472，(公开日1990年8月22日)描述的方法构建能表达胰岛素原和胰岛素原类似物的质粒。整个文献引入本文作为参考。利用重组DNA技术经类似于胰岛素原的前体分子还可以制备本发明的胰岛素类似物的A和B链。参见Frank等人，PeptidesSyntbesis-Structure-Function，Proc.Seventh Am.Pept.Symp.，Eds.D.Rich and E.Gross(1981)，该文献引入本文作为参考。利用Chance等人，PeptidesSynthesis，Structure and FunctionProc.of Seventh American Peptide Symposium(1981)的方法可以获得将单独的A和B链，不管其如何制备，结合起来的步骤，该文献引入本文作为参考。下面提供的实施例作为描述本发明的手段，而本发明并不仅限于此。实施例1Ala(B26)人胰岛素利用脱五肽(B26-30)人胰岛素以及合成的五肽Ala-Thr-Pro-Lys-Thr进行酶促半合成(逆蛋白水解作用)来制备标题胰岛素类似物。通过固相肽合成法制备五肽，而基本上按照Gattner，H.G.，(1975)Hoppe-Seyler′s Z.Physiol.Chem.，3561397-1404描述的方法，通过胃蛋白酶水解反应转移序列26-30，从生物合成的人胰岛素(Eli Lilly and Company，Indianapolis)衍生出脱五肽的人胰岛素。在ABI合成仪430A或ACT Ⅰ型200合成仪上合成肽。从Applied Biosystems，Inc.购买t-Boc-Thr(Bzl)OCH2-PAM树脂以及已保护的t-Boc-氨基酸和用于合成肽的大多数预先包装好的试剂。通过常规的HF裂解从树脂上切下该五肽。在90%HF和10%间甲苯酚中于0℃使裂解进行1小时，并真空蒸发HF。用冷的无水乙醚立即沉淀肽，再用冷的无水乙醚洗涤数次，然后最终溶于10%乙酸中并冻干。为了制备标题胰岛素类似物，将400mg的脱五肽人胰岛素和730mg的合成的五肽Ala-Thr-Pro-Lys-Thr结合在36ml含有85%1，4-丁二醇和15%1M三羟甲基氨基甲烷缓冲剂的溶液中并用浓HCl将pH调节至pH7.0-7.1。将40mg胰凝乳蛋白酶在加到蛋白质溶液中之前溶于400μl的0.01N HCl中。偶合反应在25℃进行4.5小时，并通过反相HPLC进行追踪，然后通过加入10倍体积的冷丙酮终止反应。通过离心收集沉淀，并用醚洗涤，溶于25ml含有足够的用于增溶的盐酸胍的10%乙酸中，然后上样至Sephadex G50(Superfine，5×200cm)柱上并在4℃用摩尔乙酸洗脱。合并所需的级份，并上样至反相HPLC柱Zorbax C8(2.12×25cm)上，以2.5ml/分钟的流速用45-70%B缓冲液线性梯度洗脱760分钟。洗脱缓冲液是含有0.1M NaH2PO4，pH2.1的缓冲液A，以及含有50%缓冲液A和50%CH3CN的缓冲液B。在Vydac C18柱(2.12×25cm)上进行进一步纯化并且该洗脱为45-70%B缓冲液的线性梯度，流速2.5ml/分钟。流动相由作为缓冲液A的0.1%TFA溶液以及作为缓冲液B的0.1%TFA/50%CH3CN组成。最后，获得38mg的冻干蛋白，将其进行各种分析。进行快原子轰击质谱(FAB/MS)结果给出分子量为5715.6(预料为5715.4)。以天冬氨酸作为摩尔单位(理论氨基酸比例在括号内)氨基酸组成如下，Asp，3.00(3);Thr，2.89(3);Ser，2.75(3);Glu，7.24(7);Pro，1.06(1);gly，4.00(4);Ala，2.00(2);Cys，5.24(6);Val，3.36(4);Ile，1.41(2);Leu，6.12(6);Tyr，2.83(3);Phe，2.87(3);His，2.22(2);Lys，0.99(1);Arg，1.00(1).基本上按照上面描述的同样方法制备本发明的其他胰岛素类似物。用五肽Gly-Thr-Pro-Lys-Thr作为起始材料，制备胰岛素类似物Gly(B26)HI。利用五肽Val-Thr-Pro-Lys-Thr作为起始材料，制备类似物Val(B26)HI。使用五肽Leu-Thr-Pro-Lys-Thr作为起始材料，制备类似物Leu(B26)HI。使用五肽Ile-Thr-Pro-Lys-Thr作为起始材料，制备类似物Ile(B26)HI。使用五肽Pro-Thr-Pro-Lys-Thr作为起始材料，制备类似物Pro(B26)HI。分析每一种这些类似物证明这些化合物可用作为快速作用的胰岛素类似物。实施例2筛析HPLC将各种浓度的Ala(B26)HI用DuPont Zorbax GF-250(0.94×25cm)柱进行色谱法，用含有0.2M NaCl、20mM Na2HPO4和0.001%NaN3、pH7.5的流动相洗脱。该柱子以1ml/分钟流速并在24℃进行。分配系数(Kd)与该分子的平均半径相联系。在等式Kd＝(Ve-Vo)/(Vi-Vo)中，Ve是样品的洗脱体积，Vo是采用Blue Dextran洗脱而测定的被排出的体积，并且Vi是采用DL-二硫苏糖醇洗脱而测出的内含的体积。随着胰岛素浓度的提高，胰岛素分配系数(Kd)显著降低，表明胰岛素在高浓度时趋于聚集。用丙氨酸残基代替胰岛素B26位上的酪氨酸残基产生的胰岛素类似物似乎能在某种条件下消除聚集并导致不依赖于浓度的Kd。实施例3平衡变性作用根据Brems等，(1990)Biochemistry299289-9293所述进行平衡变性实验，整个文献引入本文作为参考。通过远紫外圆形二色性，同时不断增加胍浓度而测定平衡变性作用。在3.3M盐酸胍(GdnHCl)时，Ala(B26)HI的变性转变开始。对于Ala(B26)HI，打开的自由能量(△G)是4.5KCal/mol，其相同于BHI。对于Ala(B26)HI，中点([变性的]/[天然的]＝1)的盐酸胍浓度是5.3M，而先前由Brems等人，1991，J.Biol.Chem.，2661611-1615测定的人胰岛素的相应浓度为5.0M。实施例4均衡的超离心采用均衡的超离心沉降法测定胰岛素的聚集作用。使用在Pekar，A.H.和Frank，B.H.(1972)Biochemistry 114013-4016描述的技术检测每种类似物的相关状态，该文献全部引入本文作为参考。将这些蛋白质溶于50mM氯化钠-50mM磷酸钠缓冲液中，并将pH调至7.2。用Aviv 14 DS分光光度计(Lakewood，N.J.)测定蛋白质浓度。以mg/ml为基础，BHI的消光系数是1.05，而Ala(B26)HI的消光系数是0.8000。对于BHI，BHI的单体分子量为5808而对于Ala(B26)HI为5716。用ZnCl2溶液将锌加到溶液部分，该ZnCl2溶液的浓度已采用原子光谱学方法测定。锌与蛋白质的摩尔比始终是0.5。以Spinco Model E分析用超离心机以及6-孔钛转子以及光电扫描吸收光学系统，在22℃完成均衡沉降试验。使用超速技术，以便于25小时开始均衡扫描前达到均衡。对于较稀的溶液使用标准的12mm中央部件，对于浓缩的溶液使用常规制备的3mm填充炭的埃庞环氧树脂中央部件。假定沉降作用是理想的，根据表示式Mw＝RT/(1-Vp)W2·1/r·1/c·dc/dr计算出在各种半径时的平均分子量，其中R是气体常数，T是绝对温度，W是速度，r是半径，c是浓度，p是溶剂密度。假定Ala(B26)HI与B HI具有相同部分的体积度，即0.73ml/g。将重量平均分子量除以单体分子量，并与蛋白质的总浓度比较。Ala(B26)HI显示比BHI低的自缔合趋势。例如，在3.5mg/ml(或100单位/ml)时，胰岛素具有约为单体分子量6.5倍的重量平均分子量。Ala(B26)HI具有约为单体分子量3.2倍的重量平均分子量。在0.5摩尔锌/摩尔蛋白质存在时，浓度接近0.5mg/ml时，胰岛素主要是六聚体，相反，Ala(B26)HI的缔合作用更小。随着蛋白质浓度增加。Ala(B26)HI缔合成上面所述种类的六聚体。实施例5受体结合在下文中的体外胰岛素受体结合试验中，证明了本发明胰岛素类似物的生理学作用。用由Gruppuso等人(1988)J.Clin.Endocrinal.Metab.67194-197描述的经改变的方法完成人胎盘膜的制备以及结合试验，该文献全部引入作为参考。所使用的方法是在含有100mM N-2-羟乙基哌嗪-N′-2-乙基磺酸、pH7.8、120mM NaCl、5mM KCl、1.2mM MgSO4、8mM葡萄糖以及0.25%牛血清蛋白的终体积为500μl的溶液中，将30至50μg的人胎盘膜蛋白与约10fmol的125I-胰岛素和各种浓度的未标记的胰岛素或类似物在4℃保温18小时。通过使用细胞收集器(Skatron，Lier，Morway)在用0.1%多聚氮丙啶(Polyethyleneimine)预处理的玻璃纤维滤器上收集上述保温膜。通过将置换曲线应用于一个四参数模型上而分析结合数据，该模型使用Prefit/Allfit用于测定EC50(置换半数最大结合所需的剂量)值。从四个实验得到的数据表明人胰岛素的EC50为0.34+/-0.05nM，而Ala(B26)HI的EC50为0.39+/-0.02nM，该Ala(B26)HI说明具有胰岛素效力的89%。实施例6动物研究在下列体内分析系统中证明本发明胰岛素类似物的生理学作用。用来自Charles River Laboratories(Portage，MI)的正常的雄性Sprague Dawley大白鼠作为试验动物。获得的鼠的重量范围为160-180g，并将其在具有受控光周期(7∶00a.m.-7∶00p.m.光照，700p.m.-7∶00a.m.停止光照)以及75°F的动物房中喂养1周。用Purina rat chow 5001 ad libitum喂养这些动物。在使用前将用于每个试验的所有大白鼠禁食16小时。第一次使用时其重约200g。在达到禁食时的重量约275g(经过三周)时，不再使用这些动物。在该试验中使用5只对照动物和5只试验动物。将蛋白质溶于0.05N HCl(pH1.6)中以得到100μg/ml的原液。由该原液，在普通盐水中制备了许多稀释液，分别对大白鼠皮下注射。在给药后0时、30分钟、1小时、2小时、3小时和4小时，从每个大白鼠的尾静脉中抽取100μl的血样。通过葡萄糖氧化酶方法(Sigma chemical Co.)以比色法测定葡萄糖。从0时开始计算每只大白鼠的血葡萄糖百分数变化，最后结果以试验组的平均百分数变化±SEM表示，该平均值用该天的对照组的平均变化值进行校正。用不同浓度的受试化合物进行测试，将得到的每一剂量时葡萄糖为最低值的葡萄糖变化的百分数绘制剂量效应曲线。由该曲线决定ED50值，以作为产生半数最大低血糖效应的蛋白质皮下注射剂量(μg/kg)。人胰岛素ED50是7.8+/-0.1(n＝3)而Ala(B26)HI的ED50是8.9+/-0.7(n＝2)。Ala(B26)HI具有胰岛素效力的88%。在猪模型系统上进行的研究还证明Ala(B26)HI类似物可用作为快速作用胰岛素。与人胰岛素相比，在皮下注射后40-60分钟内几乎吸收了二倍的Ala(B26)HI的量。如前面所解释的，本发明的胰岛素类似物具有降低了的二聚化或其他方式自缔结为更高分子量形式的趋势。因此一旦给药一种或多种所说类似物，活性便可以迅速起作用。通过给需要该治疗的患者施用有效量的在其B链的第26位上含有丙氨酸残基的胰岛素类似物，本发明的胰岛素类似物能有效地治疗高血糖症。本文中使用的术语“有效量”是指治疗时或预防时为了降低或维持血糖浓度所需要的一种或多种本发明的胰岛素类似物的量。通常该量的范围是每天需约10单位直至约60单位或更多(或假设每mg约29单位时需约0.3至约2mg)。但是，应明白实际给药的胰岛素类似物的量将是由内科医生根据相应的情况来确定，包括治疗的状态(即高血糖症的原因)、给药的具体类似物、所选择的非肠道给药途径、个体患者的年龄和体重以及反应和症状的严重程度。因此，上述给出的剂量范围并不能以任何方式限制本发明范围。采用药物组合物形式将本发明胰岛素类似物施用于需要该治疗(即患有高血糖症的患者)的患者，所述组合物含有有效量的至少一种胰岛素类似物并结合有一种或多种可药用的赋形剂或载体，所述类似物在其B链的26位上含有一个丙氨酸残基。为了上述目的，通常配制药物组合物，使之含有约100单位/ml或相似浓度的有效量的胰岛素类似物。这些组合物通常(但不是必需)具有非肠道给药特性，并且可以采用本领域内熟知的用于非肠道产品的常规赋形剂或载体，通过各种技术制备。参见，例如Remington′s Pharmaceutical Sciences，17th Edition，Mack Publishing Company，Easton，PA，USA(1985)，在此引入该文作为参考。例如，将所需量的至少一种胰岛素类似物悬浮于或溶于适于注射的无毒液体赋形剂如水介质中，并将悬浮液或溶液进行灭菌，可以制备适于非肠道使用的剂型，其中的类似物在其B链的26位上含有一个丙氨酸残基。为了在施用前进行混和可以附加一种小瓶或赋形剂。适用于非肠道给药的药物组合物使用稀释剂、赋形剂和载体如水和易与水混合的有机溶剂如甘油、芝麻油、花生油、丙二醇水溶液、N，N′-二甲基甲酰胺等等。这样的药物组合物的实例包括无菌的、等渗的、水性的胰岛素类似物(在B链的第26位含有丙氨酸残基)的盐溶液，并可用药物学上可接受的缓冲剂进行缓冲并且是无热原的。另外，非肠道药物制剂可以含有防腐剂如苯酚或间甲苯酚。可以使用调节最后产品的pH值的试剂例如氢氧化钠或盐酸。还可以将本发明胰岛素类似物配制成适用于鼻内给药的药物组合物。在欧洲专利申请0200383 A3中详细公开了上述组合物，引入本文作为参考。简而言之，用一种或多种可药用的稀释剂，药物学上可接受量的碱金属盐，铵盐，或基本上无锌的胰岛素的游离酸，并且任选地加入增强吸收所需量的至少一种吸收增强剂，一起配制这样的组合物，所述吸收增强剂选自于(1)油酸或其酯或盐，(2)液态的脱水山梨醇脂肪酸酯，(3)液态的脱水山梨醇脂肪酸酯的聚氧乙烯衍生物以及(4)液态的羟基聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯共聚体。序列表(1)一般性资料(ⅰ)申请人Chance等人(ⅱ)发明名称胰岛素类似物(ⅲ)序列数2(ⅳ)相应的地址(A)地址Eli Lilly and CompanyPatent Division/DKN(B)街道Lilly Corporate Center(C)城市Indianapolis(D)州IN(E)国家USA(F)ZIP46285(ⅴ)计算机可读形式(A)工具类型Diskette，3.50inch，1.0Mb Storage(B)计算机Macintosh(C)操作系统Macintosh(D)软件Microsoft Word(ⅵ)现行的申请数据(A)申请号(B)申请日(C)分类号(ⅶ)以前的申请数据(A)申请号(B)申请日(ⅷ)代理人/代理机构资料(A)姓名Douglas K.Norman(B)登记号33267(C)参考/摘要编号X8667(xi)电讯资料(A)电话(317)276-2958(B)传真(317)276-1294(C)电传(2)SEQ ID NO1的资料(ⅰ)序列特征(A)长度21个氨基酸(B)类型氨基酸(C)股数(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型多肽(ⅸ)特征(A)名称/关键词Variable Site(B)位置21(C)鉴别方法(D)其他资料“该氨基酸是Asn、Asp、Glu、Gln、Ala、Gly或Ser。”(xi)序列描述SEQ ID NO1Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln1 5 10 15Leu Glu Asn Tyr Cys Xaa20(3)SEQ ID NO2的资料(ⅰ)序列特征(A)长度30个氨基酸(B)类型氨基酸(D)几何结构线性(ⅱ)分子类型多肽(ⅸ)特征(A)名称/关键词Variable Site(B)位置1(C)鉴别方法(D)其他资料“该氨基酸是Phe或Asp。”(ⅸ)特征(A)名称/关键词Variable Site(B)位置3(C)鉴别方法(D)其他资料“该氨基酸是Asn或Asp。”(ⅸ)特征(A)名称/关键词Variable Site(B)位置26(C)鉴别方法(D)其他资料“该氨基酸是Ala、Gly、Val、Leu、Ile或Pro”。(xi)序列描述SEQ ID NO2Xaa Val Xaa Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu1 5 10 15Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Xaa Thr Pro Lys Thr20 25 30权利要求1.正确地交联在SEQ ID NO∶2上的通式SEQ ID NO∶1的胰岛素类似物，或其可药用的盐，其中在SEQ ID NO∶1的第21位上的Xaa选自于Asn、Asp、Glu、Gln、Ala、Gly或Ser，在SEQ ID NO∶2的第1位上的Xaa选自于Asp或Phe，在SEQ ID NO∶2的第3位上的Xaa选自于Asp或Asn，以及在SEQ ID NO∶2的第26位上的Xaa选自于Ala、Gly、Val、Leu、Ile和Pro。2.根据权利要求1所述的胰岛素类似物，其中SEQ ID NO1的第21位上的Xaa是Asn。3.根据权利要求2所述的胰岛素类似物，其中SEQ ID NO2的第1位上的Xaa是Phe。4.根据权利要求3所述的胰岛素类似物，其中SEQ ID NO2的第3位上的Xaa是Asn。5.根据权利要求4所述的胰岛素类似物，其中SEQ ID NO2的第26位上的Xaa中Ala。6.一种药物制剂，包括存在于一种可药用的稀释剂中的正确地交联至SEQ ID NO2上的通式SEQ ID NO1的胰岛素类似物，或其可药用的盐，其中在SEQ ID NO1的第21位上的Xaa选自Asn、Asp、Glu、Gln、Ala、Gly或Ser，SEQ ID NO2的第1位上的Xaa选自于Asp或Phe，SEQ ID NO2的第3位上的Xaa选自Asp或Asn，以及SEQ ID NO2的第26位上的Xaa选自Ala、Gly、Val、Leu、Ile和Pro。7.根据权利要求6所述的药物制剂，其中在SEQ ID NO1的第21位上的Xaa是Asn，在SEQ ID NO2的第1位上的Xaa是Phe，在SEQ ID NO2的第3位上的Xaa是Asn，以及在SEQ ID NO2的第26位上的Xaa是选自Ala、Gly、Val、Leu、Ile和Pro。8.根据权利要求7所说的药物制剂，其中SEQ ID NO2的第26位上的Xaa是Ala。9.一种制备如权利要求1至5中任何一项所说的胰岛素类似物的方法，该方法包括将SEQ ID NO1化合物与SEQ ID NO2化合物交联在一起。10.根据权利要求9所述方法制备的胰岛素类似物。全文摘要在B链的第26位上含有Ala、Gly、Val、Leu、IIe或Pro残基，并且任选地在其他位点进行了改变的人胰岛素类似物。该类似物具有改变了的理化特性和药学动力学特性。由于这些类似物是稳定的并且具有较低的自缔合趋势而可用于治疗高血糖症。文档编号C07K14/62GK1094059SQ93112839公开日1994年10月26日 申请日期1993年12月17日 优先权日1992年12月18日发明者R·E·钱斯, 范利 申请人:伊莱利利公司