心肌细胞生长刺激肽(cmgsp)的制备方法

专利名称：心肌细胞生长刺激肽(cmgsp)的制备方法技术领域：本发明涉及的是心肌细胞生长刺激肽(CMGSP)技术领域。一般具有刺激心肌细胞DNA合成和蛋白合成，促进其分裂增殖的细胞因子，是从自发性高血压大鼠或实验性高血压动物的心肌中提取。据文献介绍尚有Nagano M等人、Subha S等人进行此项研究。其共同特点是心生长因子(CGF)的提取均用病理性高血压动物心肌。本发明的目的在于提供一种从健康的幼年哺乳动物的心肌中，制备出一种具有较高的生物活的(CNGSP)的方法，并采用特异的冷冻干燥曲线(方法)，将(CMGSP)冻干，使其可较长期保持活性。本发明的目的可通过以下技术措施来达到，选取健康的幼年哺乳动物心脏，采用任何机械方式，将其捣碎-20℃深冻-融解后加热60-100℃，15分钟-恢复至室温后再-20℃深冻-融解后，离心3000rpm，30分钟-上清液进负压截留柱-除菌-分装-冻干-包装。本发明的目的还可以通过以下技术措施来达到截留柱系采用中空纤维超滤柱，其截留分子量≤20000Da，负压在0.5×104Pa，超滤柱组合方式可为单一柱或多柱串联使用;制备的心肌细胞生长刺激肽(CMGSP)活性保持冷冻干燥是加入3-8%甘露，-40℃速冻维持2小时30分钟后，于半小时内升温至0℃，持续3小时，然后在1小时内升温至37-38℃，维持20小时。冻融方法可重复1至数次。本发明制备的(CMGSP)具有较高的生物活性，表现生物活性方法取SD胚胎鼠(孕12-16天)，无菌分离心脏，胰蛋白酶分离心肌细胞，用DMEM培养基洗涤3次后，用含10%小牛血清的DME/F12培养基配制2-5×105个细胞/ml，置96孔培养板内，每孔0.15ml，37℃，5% CO2条件下孵育24小时。用无血清DME/F12培养基换液后，实验孔加入5-40μg/孔的CMGSP，对照孔仅加DME/F12培养基，继续培养48小时，每孔加入5μIMTT(1.5mg/ml，DME培养基配制)，继续培养4-6小时，每孔加入二甲基亚砜100μl终止反应置酶标仪570nm条件下测OD值，以实验孔/对照孔＞1.7倍为有活性。测定结果如下CMGSP对培养中心肌细胞线粒体脱氢酶活力的影响nOD倍数P值对照组80.108±0.01实验组(μg)540.143±0.021.3>0.051040.233±0.032.2<0.012040.243±0.022.3<0.014040.195±0.041.8<0.05本发明制备的CMGSP的药理作用明显，心肌细胞坏死数量少，淋巴细胞浸润程度轻，心肌细胞结构清晰。本发明制备的心肌细胞生长刺激肽(CMGSP)的健康的幼年哺乳类动物选自人、猪、牛、马、羊、狗、兔。本发明制备的心肌细胞生长刺激肽(CMGSP)可制成口服药和肌肉注射，或其它药物配伍静脉滴入给药。本发明实施1、将心肌细胞生长刺激肽(CMGSP)液体加入3-8%甘露分装5ml药用易析安瓿中，每瓶5ml液体，-40℃速冻维持2.5小时，半小时后提高温度至0℃，持续3小时，然后在1小时内提高温度至37-38℃，维持20小时。冻干为5ml药用易析安瓿，也适合于其它5-10ml药用营子瓶或模子瓶。权利要求1.一种稳定的心肌细胞生长刺激肽(CMGSP)的制备方法及其制备的心肌细胞生长刺激肽活性保持的冻干曲线，其特征是所述的制备方法选取健康的幼年哺乳动物心脏，用任何机械方式捣碎--20℃深冻-融解后加热60-100℃，15分钟-恢复至室温后再-20℃深冻-融解后，离心3000rpm，30分钟-上清液进负压截留柱-除菌-分装-冻干-包装。2.根据权利要求1所述的心肌细胞生长刺激肽制备方法，其特征是截留柱系采用中空纤维超滤柱，其截留分子量≤20000Da，负压在0.5×104Pa，超滤柱组合方式可为单一柱或多柱串联使用，3.根据权利要求1所述的制备的心肌细胞生长刺激肽活性保持冷冻干燥曲线，其特征是加入3-8%甘露，-40℃速冻维持2小时30分钟后，于半小时内升温至0℃，持续3小时，然后在1小时内升温至37-38℃，维持20小时。全文摘要心肌细胞生长刺激肽(CMGSP)的制备方法及冷冻干燥曲线。是选自健康的幼年哺乳类动物的心脏经任何机械方式捣碎、经深冻、加热、深冻、离心、上清液进负压截留柱、除菌、分装、冻干、包装流程制得，保持生物活性是将CMGSP液体加入甘露醇分装5ml药用易析安瓿中经速冻、升温、提高温度、维持温度，在-20-30℃避光条件下，CMGSP生物活性可保持3年稳定，其生物活性等于液体状态下的心肌细胞生长刺激肽。文档编号C07K19/00GK1108663SQ94102798公开日1995年9月20日 申请日期1994年3月15日 优先权日1994年3月15日发明者孔祥平, 邹清雁, 张宜俊, 郑国池, 张晓坤 申请人:中国人民解放军第458医院