一种TFAM条件性敲除的细胞系、心肌细胞及其构建方法和应用

本发明属于干细胞与再生医学，具体涉及一种tfam条件性敲除的细胞系、心肌细胞及其构建方法和应用。

背景技术：

1、心脏作为高度动态的器官，其周期性泵血功能离不开心肌细胞中的线粒体能量的供应。线粒体不仅是心肌细胞能量代谢的供给中心，同时也参与细胞内环境缓冲与命运转化调控，一旦其因遗传因素或环境因素受损诱发功能障碍，便会引起从心肌细胞到心肌组织再到心脏整体的级联性功能失常，引起心肌病。临床通常表现为肥厚和扩张型心肌病、心律失常、左心室心肌致密化不全和心力衰竭，在心肌发育过程中心肌对能量需求的增加和成体对能量需求度增高时，线粒体代谢占比上升导致疾病的迅速恶化。线粒体心肌病发病诱因多、病程时间长、致病机制复杂，且临床病程和组织表型存在很大的异质性，而相关疾病建模所依赖的各类动物又无法摆脱种间差异的桎梏，导致目前尚无有效的治疗干预手段应对原发或并发的线粒体心肌病，亟需新的模型为线粒体心肌病的病程解析与病症治疗提供新的视角。

2、线粒体心肌病一般可分为遗传性和继发性。继发性线粒体心肌病，一般都是由于后天线粒体的损伤导致。遗传性线粒体心肌病是由于mtdna或ndna出现致病型突变导致。由于mtdna没有内含子且没有组蛋白的包裹保护，属于一段裸露的环状dna，这也导致线粒体dna存在较高的突变几率，较正常ndna高10倍，但由于线粒体的数目和mtdna拷贝数众多，并没有导致高的致病率，据目前统计线粒体心肌病的患病率约两万分之一。tfam是由核基因编码的蛋白，在细胞质中合成并导入到线粒体中，可以调节mtdna的复制与转录，转录出的物质编码了线粒体呼吸链的13种基本成分，过表达或抑制tfam基因，将相应地引起mtdna水平升高或减少，揭示出tfam是mtdna一个剂量依赖性的影响因子,是一种可干预线粒体损伤的对象。

3、人诱导多能干细胞(human inducedpluripotent stem cell,hipsc)是一类具有多向分化潜能的种子细胞，因其来源不受伦理道德限制且具备很强的可编辑性，由此衍生的各类终末分化细胞在体外疾病模拟、发病机制解析、药物筛选方面具有极为广泛的应用实例与前景。同样，人诱导多能干细胞衍生心肌细胞(human inducedpluripotent stemcell-derived cardiomyocytes,hipsc-cms)可作为研究线粒体心肌病发生发展的理想对象。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种tfam条件性敲除的细胞系、心肌细胞及其构建方法和应用，利用所述细胞系定向分化成心肌细胞，构建心肌微组织以建立稳定的线粒体心肌病体外细胞和组织疾病模型，可批量生产满足高通量实验需求缩短实验周期，以利于广泛用于疾病表型分析和功能学研究，疾病分子机制研究，治疗药物筛选和安全性评估。

2、本发明提供了由tfam条件性敲除的dox-induced-tfamko细胞系定向分化得到的心肌细胞。

3、优选的，所述tfam条件性敲除的dox-induced-tfamko细胞系的构建方法，包括以下步骤：(1)向人类诱导多能干细胞中敲入外源tfam组件，得dox-induced-tfamki细胞；

4、(2)敲除所述dox-induced-tfamki细胞的内源tfam组件，得tfam条件性敲除的dox-induced-tfamko细胞系。

5、优选的，步骤(1)中在aavs1位点靶向敲入外源tfam组件。

6、优选的，步骤(1)中所述外源tfam组件相比于内源tfam组件，在tfam切割位点做同义突变，并在终止密码子前携带标签。

7、优选的，所述外源tfam组件在ncbi中的登录号为7019；

8、所述敲入的外源tfam组件的核苷酸序列如seq id no.1所示。

9、本发明还提供了利用上述tfam条件性敲除的dox-induced-tfamko细胞系定向分化为心肌细胞的方法，包括以下步骤：将dox-induced-tfamko细胞系传代至80％～90％汇合度时更换为分化培养基进行定向分化，所述分化培养基由rpmi 1640培养基与b27-insulin(多化合物的复合体，50x)和抗坏血酸(50μg/ml)混合而成。

10、优选的，所述定向分化，包括：

11、定向分化第0天，添加培养基为含0.75μm chir 99021的分化培养基；

12、定向分化第1天，添加培养基为含0.6u/ml heparin(肝素)的分化培养基；

13、定向分化第2～4天，添加培养基为含0.6u/mlheparin和0.3μm iwp2的分化培养基；

14、定向分化第5～6天，添加培养基为含0.6u/mlheparin的分化培养基；

15、定向分化第7天后，添加培养基为含100ng/ml dox的分化培养基；

16、定向分化第14天进行撤dox处理，得到不同程度线粒体损伤的心肌细胞。

17、本发明还提供了利用上述心肌细胞构建得到的人源性线粒体心肌病细胞模型。

18、本发明还提供了利用上述心肌细胞构建得到的人源性线粒体心肌病组织模型。

19、本发明还提供了上述人源性线粒体心肌病细胞模型或上述人源性线粒体心肌病组织模型在筛选和/或研制线粒体心肌病药物中的应用。

20、本发明还提供了利用上述人源性线粒体心肌病细胞模型或上述人源性线粒体心肌病组织模型筛选得到的阿拉莫林和/或巴瑞替尼在制备回补线粒体损伤的药物中的应用。

21、有益效果：本发明提供了一种tfam条件性敲除的dox-induced-tfamko细胞系的构建方法，在人类诱导多能干细胞(hipsc)中在aavs1位点插入外源tfam组件，该组件可被dox诱导表达，然后通过内源性tfam敲除，得到一系列hipsc细胞系，其外源tfam表达可通过添加dox进行调控。

22、本发明利用上述hipsc细胞系在体外定向分化为心肌细胞(hipsc-cm)，并利用这些分化的心肌细胞构建了稳定的2d和3d线粒体心肌病模型，用于线粒体心肌病的研究和药物筛选等应用。本发明使用了人源性诱导多能干细胞来源的心肌细胞，通过控制去除dox的时间窗口，实现了hipsc-cm中tfam的短期缺失和长期缺失。这种可实时调控的细胞和组织心肌病模型具有重要意义。本发明所述方法不需要繁琐的动物培养，可实时通过dox调控tfam缺失时间对疾病的不同进展进行研究，同时可以长时间体外培养，可批量生产满足高通量实验需求缩短实验周期，以利于广泛用于疾病表型分析和功能学研究，疾病分子机制研究，治疗药物筛选和安全性评估。

23、基于该线粒体心肌病模型，对2572种获得上市批准的原料药和1384种天然产物的抗线粒体损伤效果进行综合评估。通过以平面hipsc-cm凋亡为筛选标志进行初步药物筛选，筛选出了6种候选化合物。此外，在心肌组织层面以收缩力功能恢复为筛选标准，进一步获得了具有回补线粒体损伤效果的两种化合物，这一研究展示了该模型在药物筛选方面的良好应用前景。