基于CDs的小核酸植物递送系统及其制备方法与应用

本发明属于生物医学材料领域，具体涉及一种基于cds的小核酸植物递送系统及其制备方法与应用。

背景技术：

1、目前病虫害对全球粮食安全造成了严重的威胁，据估计，每年约有20-40％的粮食产量因病虫害而损失。传统化学农药面临高污染、低生物利用度等问题，开发绿色安全的生物防控策略，对农业的可持续发展具有重要意义。rna干扰(rnai)技术通过小干扰rna(sirna)片段特异性沉默病虫害入侵相关基因，在植物的病虫害防控中具有重要应用前景。传统植物rnai技术的利用主要通过基因工程手段，以构建可产生特定sirna的转基因植物。然而，植物转基因技术面临周期长、效率低等问题，此外，传统植物转基因技术主要通过基因枪及农杆菌转染将核酸分子递送进植物细胞中，这些方法存在易损伤植物细胞、可被转染宿主种类有限等问题。因此，开发新型核酸递送系统，对发展便捷高效植物转基因技术、探索小核酸药物在植物育种及保护中的应用等方向，具有重要意义。

2、近年来兴起的纳米材料介导的外源基因递送技术，有望克服传统植物核酸转染所面临的困境，介导安全、高效、快速的植物核酸递送，推动核酸生物农药技术在植物病虫害防治中的应用。纳米材料作为基因递送载体已广泛应用于动物，其在植物中的应用尚处于起始阶段。现有研究表明，受限于植物细胞壁的孔径尺寸，可扩散跨越植物细胞壁，进入植物细胞的纳米颗粒尺寸一般需至少在一个维度上小于20nm。碳量子点(cds)是直径小于10nm的零维碳材料。它们具有光致发光等特性，已广泛应用于生物医学、光催化、太阳能转换等领域。cds的稳定性和荧光特性增强了它们在植物中的细胞摄取、转移和积累。此外，cds对植物生长、发育、光合作用和抗非生物/生物胁迫的影响是近年来研究的热点。开发基于cds的小核酸植物递送系统，不仅可拓宽cds的应用方向，更为新型植物核酸递送带来新策略，优化植物基因工程技术手段，推动植物sirna生物农药的应用转化，对农业的高效可持续发展具有重要意义。

技术实现思路

1、碳纳米材料因其优异的机械、电、光学和热性能而具有许多优良的应用。然而，目前大多数的科学研究都集中在碳纳米材料与哺乳动物细胞之间的相互作用上，而将碳纳米材料作为载体将外源基因传递到植物细胞中的问题仍在研究中。若能够有效地利用碳点材料作为载体，将小核酸药物传递到植物细胞内，这将为植物基因编辑和疾病治疗提供全新的途径。

2、本发明旨在提供一种基于cds的小核酸植物递送系统及其制备方法与应用，通过静电吸附作用将带负电的sirna吸附在碳量子点表面形成纳米复合物，不仅提高了sirna在植物体内的稳定性，还能够实现对sirna的精准递送，为植物基因治疗和功能基因研究提供了强有力的支持。

3、本发明的技术方案如下：

4、一种基于cds的小核酸植物递送系统，由带负电的sirna通过静电作用包裹到带正电的pei-cds外层而形成；其中，pei-cds是指聚乙烯亚胺(pei)修饰的碳量子点(cds)。

5、本发明所述的基于cds的小核酸植物递送系统的制备方法，包括如下步骤：

6、(1)采用微波辅助水热法合成pei-cds

7、将甘油与聚乙烯亚胺溶于pbs溶液(ph＝7.2-7.4)中，搅拌混匀(30min)，在700w微波下处理6min，之后冷却至室温，加入超纯水超声(30min)，用mwco值为1kda的透析袋在超纯水中透析24h，将剩余的透析液冻干，得到pei-cds(4℃保存)；

8、优选甘油与聚乙烯亚胺的体积质量比为20：0.25，ml/g；优选分子量10000的聚乙烯亚胺；

9、优选甘油与pbs溶液的体积比为20：6；

10、(2)制备基于cds的小核酸植物递送系统

11、将步骤(1)所得pei-cds与游离的sirna混合，室温孵育30min，sirna通过静电作用包裹到pei-cds外层，即得。

12、本发明所述的基于cds的小核酸植物递送系统可应用于植物基因递送，具体例如用于植物基因转化、基因编辑等。

13、并且，本申请所述的基于cds的小核酸植物递送系统也可以应用于植物基因沉默，具体例如用于外源gfp基因沉默，或者用于内源pds基因及chlh基因沉默。

14、本发明的技术原理包括：

15、碳量子点(cds)是一种具有无毒、低成本、生物相容性好的量子点的“绿色替代品”。将甘油作为碳源，通过微波反应合成cds。其中将聚乙烯亚胺(pei)引入cds表面，使cds带正电荷，使其能够通过静电吸附作用吸附带负电荷的核酸药物。此外，cds具有小于10nm的直径，这种尺寸有助于有效地将其内化到完整的植物细胞内，并实现核酸的递送。

16、小干扰rna(sirna)通过特异性地抑制病原体和虫害相关基因的表达，来控制植物病虫害。这项技术利用小干扰rna(sirna)分子介导基因沉默，提供了一种高效、可持续且环境友好的方法。相比传统农药，sirna干扰技术减少了对化学农药的依赖，为农业生产提供了更可持续的解决方案。通过设计和合成与病原体和虫害相关基因序列相匹配的sirna分子，可以将其导入植物细胞，从而特异性地抑制目标基因的表达。这种抑制作用可以阻断病原体侵染和虫害发展的关键步骤，从而有效地控制植物病虫害。sirna干扰技术在植物抗病虫害防治方面具有广阔的应用前景，但由于直接利用裸sirna的易降解、转染效率低和非特异性的生物分布等缺点，其治疗效果并不令人满意。因此，迫切需要开发新的载体将sirna导入植物细胞。以pei作为钝化剂的cds表面带正电，可以通过静电相互作用吸附带负电的sirna，并且保护sirna不受生物体内酶降解的影响，进一步实现将sirna有效负载与精确释放到完整植物细胞中。

17、本发明的有益效果在于：

18、1.本发明核酸功能化的碳量子点核酸载体系统，cds由一种简单、低成本的微波碳化方式合成，可以负载dna、rna等多种核酸物质。可以防止核酸物质被核酸酶降解，从而保持其生物活性。这种核酸载体较稳定且生物安全性良好。

19、2.cds由甘油和聚乙烯亚胺(pei)通过微波反应碳化而形成，在水溶液中稳定存在，且长时间储存后仍稳定存在。

20、3.基于植物体本身的完整结构，植物细胞外层存在一层致密且结实的细胞壁。这层细胞壁的存在导致植物细胞排除外来物质的尺寸只有5-20nm。据研究表明，在纳米材料介导的植物基因递送领域，目前大多数的粒子至少在一个维度上需要小于20nm。量子点材料是一类核壳结构的尺寸为1-10nm纳米颗粒。碳量子点作为量子点的“绿色”替代品，以小粒径、无毒、低成本和生物相容性好等特点，在植物基因递送领域发挥了作用。

21、4.基因治疗药物具有高特异性、靶点丰富、长效性等优势，然而核酸的不稳定性和负电性使其很难进入细胞。针对上述，利用cds负载基因治疗药物可以提高药物稳定性和靶向作用。

技术特征：

1.一种基于cds的小核酸植物递送系统，其特征在于，由带负电的sirna通过静电作用包裹到带正电的pei-cds外层而形成；其中，pei-cds是指聚乙烯亚胺修饰的碳量子点。

2.如权利要求1所述的基于cds的小核酸植物递送系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，甘油与聚乙烯亚胺的体积质量比为20：0.25，ml/g。

4.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，甘油与pbs溶液的体积比为20：6。

5.如权利要求1所述的基于cds的小核酸植物递送系统在植物基因递送或者植物基因沉默中的应用。

技术总结本发明公开了一种基于CDs的小核酸植物递送系统及其制备方法与应用，所述的基于CDs的小核酸植物递送系统由带负电的siRNA通过静电作用包裹到带正电的PEI‑CDs外层而形成；本发明通过静电吸附作用将带负电的siRNA吸附在碳量子点表面形成纳米复合物，不仅提高了siRNA在植物体内的稳定性，还能够实现对siRNA的精准递送，为植物基因治疗和功能基因研究提供了强有力的支持。技术研发人员：王芳,贾敬妍,周澳,纪雪洋受保护的技术使用者：浙江工业大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18