一种基于CRISPR-Cas9技术构建的表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其构建方法

本发明涉及一种基于crispr-cas9技术构建的表达h3n8禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其构建方法，属于基因工程。

背景技术：

1、低致病性禽流感病毒h3n8感染主要导致家禽产蛋下降和呼吸道疾病，且可跨宿主传播。本发明以血清4型禽腺病毒为载体，将h3n8禽流感病毒的ha基因替换血清4型禽腺病毒的fiber-2基因，成功构建了表达h3n8禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒，为联合防控血清4型禽腺病毒和h3n8禽流感病毒提供了二联候选疫苗毒株。

技术实现思路

1、本发明的目的就在于克服上述缺陷，提供一种基于crispr-cas9技术构建的表达h3n8禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其构建方法。

2、为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一种基于crispr-cas9技术构建的表达h3n8禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒，其特征是：

4、h3n8禽流感病毒ha蛋白，其序列如seq id no.1所示；

5、重组血清4型禽腺病毒，其中使用h3n8禽流感病毒ha基因替换血清4型禽腺病毒fiber-2基因，替换的是血清4型禽腺病毒fiber-2基因的253位核苷酸到1440位核苷酸。

6、一种基于crispr-cas9技术构建的表达h3n8禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

7、(1)利用sgrna在线设计网站设计针对血清4型禽腺病毒fiber-2基因的sgrna，其序列如表1所示；

8、

9、(2)通过pcr和同源重组的方法构建携带h3n8禽流感病毒ha基因和rfp表达盒的供体质粒，其中rfp表达盒两端都带有loxp位点，pcr使用的引物序列如表2所示；

10、表2构建供体质粒所用的pcr引物

11、

12、(3)6孔板接种lmh细胞培养过夜，共转染sgrna和供体质粒各3μg，转染6h后去除转染上清并加培养液；转染12h后感染表达egfp的重组4型腺病毒(fa4-egfp)，感染2h后换成细胞维持液；

13、(4)感染fa4-egfp后观察rfp红色荧光，利用空斑试验和有限稀释的方法进行红色荧光重组病毒的纯化，获得带有rfp表达盒的表达h3n8禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒；

14、(5)纯化后的红色荧光重组病毒接种转染cre重组酶的lmh细胞，4d后取感染的细胞上清再次接种转染cre重组酶的lmh细胞，重复该过程直至红色荧光病毒完全消失；使用pcr、i fa和western blot的方法对去除rfp表达盒的表达h3n8禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒进行鉴定。

15、表达egfp的重组病毒fa4-egfp，其特点是能够表达绿色荧光egfp，区别于重组病毒的红色荧光蛋白rfp，便于快速纯化重组病毒，重组病毒fa4-egfp的详细构建方法见专利cn112877303a。

16、本发明方法先进科学，通过本发明，本发明的目的是基于crispr-cas9技术构建表达h3n8禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒，本发明的关键技术是利用crispr-cas9技术在血清4型禽腺病毒中插入h3n8禽流感病毒ha基因以及带有loxp位点的rfp表达盒，利用rfp蛋白进行病毒的纯化，纯化完成后使用cre重组酶敲除rfp表达盒，最后获得可以稳定表达h3n8禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒。

17、本发明所述的是一种基于crispr-cas9技术构建的表达h3n8禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒，利用当下流行的血清4型禽腺病毒作为载体插入h3n8禽流感病毒ha基因，成功获得了表达h3n8禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒，此重组病毒可作为免疫防控h3n8以及血清4型腺病毒的二联疫苗候选株。

技术特征：

1.一种基于crispr-cas9技术构建的表达h3n8禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒，其特征是：

2.如权利要求1所述的一种基于crispr-cas9技术构建的表达h3n8禽流感病毒ha蛋白的重组血清4型禽腺病毒的制备方法，其特征是：该制备方法包括以下步骤：

3.如权利要求2中所述的制备方法，其特征是：表达egfp的重组病毒fa4-egfp，其特点是能够表达绿色荧光egfp，区别于重组病毒的红色荧光蛋白rfp，便于快速纯化重组病毒。

技术总结本发明涉及一种基于CRISPR‑Cas9技术构建的表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒及其构建方法，H3N8禽流感病毒HA蛋白，其序列如SEQ ID NO.1所示；重组血清4型禽腺病毒，其中使用H3N8禽流感病毒HA基因替换血清4型禽腺病毒Fiber‑2基因，替换的是血清4型禽腺病毒Fiber‑2基因的253位核苷酸到1440位核苷酸。本发明利用当下流行的血清4型禽腺病毒作为载体插入H3N8禽流感病毒HA基因，成功获得了表达H3N8禽流感病毒HA蛋白的重组血清4型禽腺病毒，此重组病毒可作为免疫防控H3N8以及血清4型腺病毒的二联疫苗候选株。技术研发人员：汤也,姜文杰,蒋蕙如,聂雨晴,万志敏,叶建强,谢泉,邵红霞,秦爱建,李拓凡受保护的技术使用者：扬州大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18