一种糖类抗原CA125的表达方法和纯化方法及应用与流程

本申请属于疾病的诊断，更具体地说，是涉及一种糖类抗原ca125的表达方法和纯化方法。

背景技术：

1、糖类抗原ca125由黏蛋白16(mucin 16，muc16)基因编码，是一种大型跨膜糖蛋白，包含约14000个氨基酸，分子量约3～5mda，结构复杂，存在跨膜区和大量o-连接糖基化和n-连接的糖基化位点。糖类抗原ca125作为卵巢癌的特异性诊断标志物，应用于卵巢癌的早期筛查、病情检测和疗效评估。

2、目前，糖类抗原ca125主要通过体外重组表达和经人体组织/体液提取获得。重组糖类抗原ca125仅表达部分结构，且糖基化修饰存在较大差别，并不能完全代表完整的糖类抗原ca125，而天然提取的糖类抗原ca125来源受限，纯化过程中蛋白易发生并行和降解，导致蛋白结构不均一、批间差大的问题。有文献报道通过培养肿瘤细胞，如ovcar-3细胞，可获得具有天然构象的糖类抗原ca125的细胞培养上清，但肿瘤细胞培养上清中抗原浓度低，需经特异性抗体亲和纯化获得抗原，操作过程复杂、成本高，不适于大量制备。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题为：如何获得浓度高且完整的糖类抗原ca125。

2、第一方面，本发明的技术方案为：一种糖类抗原ca125的表达方法，包括以下步骤：

3、复苏ovcar-3细胞到ca125培养基中，在35～39℃和1～8％co2下培养；

4、当细胞生长至汇合度为80％～95％时，按1:3～1:4传代，继续培养细胞并进行传代，直至传代达到所需瓶数；

5、ovcar-3传代培养3天，向细胞添加ca125补料，培养至8～12天，收集细胞培养上清，向细胞瓶内细胞添加ca125培养基继续培养、补料和收集上清，重复6～10次；

6、收集的上清离心，去除细胞碎片，-20℃保存备用。

7、作为一种可能的设计，所述ca125补料中含有如下成分：ca125培养基，1.5～2.5g/l胰蛋白胨，1.5～2.5g/l酵母提取物，0.3～0.6g/l碳酸钠，0.8～1.2g/l碳酸氢钠，3～5g/l半乳糖，3～6g/l果糖，1.5～3.0g/l葡萄糖，2wt％mem neaa。

8、作为一种可能的设计，所述ca125补料中含有如下成分：ca125培养基，2g/l胰蛋白胨，2g/l酵母提取物，0.5g/l碳酸钠，1.0g/l碳酸氢钠，2g/l半乳糖，4g/l果糖，2g/l葡萄糖，2wt％mem neaa。

9、作为一种可能的设计，所述ca125培养基包括以下组分：rpmi-1640培养基，5wt％～10wt％fbs，1wt％青霉素-链霉素(100×)，10μg/ml胰岛素，0.2～0.6g/l葡萄糖。

10、作为一种可能的设计，所述ca125培养基包括以下组分：rpmi-1640培养基，8wt％fbs，1wt％青霉素-链霉素(100×)，10μg/ml胰岛素，0.4g/l葡萄糖。

11、作为一种可能的设计，所述ca125补料的补给频率为每1～3天1次，优选每2天1次；所述ca125补料补给量为4vol％/次。

12、第二方面，本发明提供一种糖类抗原ca125的纯化方法，包括：

13、将上清液进行解冻和混合，纯化获得清澈的上清液；

14、使用硫酸铵沉淀糖类抗原ca125，离心收集沉淀；

15、采用缓冲液对沉淀进行复融，后进行透析，获得透析液；

16、对透析液进行离心分离，获得上清液，-20℃保存。

17、作为一种可能的设计，所述加入上清液中的硫酸铵饱和度为80wt％～90wt％，优选85wt％。

18、作为一种可能的设计，透析过程中透析袋的孔径为14kda。

19、本发明的有益效果为：

20、利用改进的培养基配方和补料培养的方式，体外培养ovcar-3细胞，表达的糖类抗原ca125，不仅保留糖类抗原ca125的天然构象，操作简单、所获细胞培养上清中糖类抗原ca125浓度高；利用简单的纯化工艺进行纯化，过程简单，普适性更强，可大量制备且成本低。制得的糖类抗原ca125可作为ca125的检测试剂中的主要成分使用，还可以作为校准品、标准品或质控品使用。

技术特征：

1.一种糖类抗原ca125的表达方法，其特征在于，所述表达方法包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的糖类抗原ca125的表达方法，其特征在于，所述ca125补料中含有如下成分：ca125培养基，1.5～2.5g/l胰蛋白胨，1.5～2.5g/l酵母提取物，0.3～0.6g/l碳酸钠，0.8～1.2g/l碳酸氢钠，3～5g/l半乳糖，3～6g/l果糖，1.5～3.0g/l葡萄糖，2wt％mem neaa。

3.根据权利要求2所述的糖类抗原ca125的表达方法，其特征在于，所述ca125补料中含有如下成分：ca125培养基，2g/l胰蛋白胨，2g/l酵母提取物，0.5g/l碳酸钠，1.0g/l碳酸氢钠，2g/l半乳糖，4g/l果糖，2g/l葡萄糖，2wt％mem neaa。

4.根据权利要求1所述的糖类抗原ca125的表达方法，其特征在于，所述ca125培养基包括以下组分：rpmi-1640培养基，5wt％～10wt％fbs，1wt％青霉素-链霉素(100×)，10μg/ml胰岛素，0.2～0.6g/l葡萄糖。

5.根据权利要求4所述的糖类抗原ca125的表达方法，其特征在于，所述ca125培养基包括以下组分：rpmi-1640培养基，8wt％fbs，1wt％青霉素-链霉素(100×)，10μg/ml胰岛素，0.4g/l葡萄糖。

6.根据权利要求1所述的糖类抗原ca125的表达方法，其特征在于，所述ca125补料的补给频率为每1～3天1次，优选每2天1次；所述ca125补料补给量为4wt％/次。

7.一种糖类抗原ca125的纯化方法，其特征在于，所述纯化方法包括：

8.根据权利要求7所述的糖类抗原ca125的纯化方法，其特征在于，所述硫酸铵加入上清液中的浓度为80wt％～90wt％，优选85wt％；优选地，透析过程中透析袋的孔径为14kda。

9.一种权利要求7或8所述纯化方法获得的上清液或权利要求1-6任一项所述表达方法获得的上清液在制备ca125检测试剂中的应用。

10.一种权利要求7或8所述纯化方法获得的上清液或权利要求1-6任一项所述表达方法获得的上清液作为校准品、标准品或质控品的应用。

技术总结本申请提供了一种糖类抗原CA125的表达方法和纯化方法及应用，表达方法包括复苏OVCAR‑3细胞到CA125培养基中，在35～39℃和1～8％CO<subgt;2</subgt;下培养；当细胞生长至汇合度为80％～95％时，按1:3～1:4传代，继续培养细胞并进行传代，直至传代达到所需瓶数；OVCAR‑3传代培养3天，向细胞添加CA125补料，培养至8～12天，收集细胞培养上清，向细胞瓶内细胞添加CA125培养基继续培养、补料和收集上清，重复6～10次；收集的上清离心，去除细胞碎片，‑20℃保存备用。保留糖类抗原CA125的天然构象，操作简单、所获细胞培养上清中糖类抗原CA125浓度高。技术研发人员：刘欢欢,柳乐,王健,周献军,黄敬双,鲜静,张伟,曾红受保护的技术使用者：四川携光生物技术有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18