基于DNA水凝胶的垂直纸基传感器及miRNA检测方法与流程

本发明涉及dna水凝胶及生物传感器领域，特别涉及一种基于dna水凝胶的垂直纸基传感器及mirna检测方法。

背景技术：

1、目前检测mirna浓度的方法包括荧光定量pcr、微阵列芯片、比色法、电化学法、表面等离子共振和表面增强拉曼散射法等，尽管这些方法通常具有较高的灵敏度和优异的检测性能，但存在设备要求高、样品处理复杂、检测过程繁琐等问题。为了满足即时检测的需求，进一步简化检测程序、降低检测成本，基于距离分析的纸基传感器受到越来越多的关注。然而，目前的纸基传感装置多采用在纸基基底上蜡打印疏水图案来制备，通常需要一个较大的样品区和极细的检测区域。通过在检测区沉积比色试剂，耗尽反应物达到反应终点的方式进行信号生成和读取。这种方法存在预处理过程复杂、沉积不均匀、反应终点不清晰等问题，并且灵敏度和准确性难以达到较高的水平，从而限制了它的广泛应用。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术中的不足，提供一种基于dna水凝胶的垂直纸基传感器及mirna检测方法。

2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种基于dna水凝胶垂直纸基传感器的mirna检测方法，该方法为：将待测样本加入含有模板链和dna聚合酶、切刻内切酶的反应体系中，反应后再加入连接链l2和预先制备的y型dna，反应后所得产物溶液转移至样品池内，样品池上方设置有垂直布置的滤纸条，且滤纸下边缘接触样品池内液面，记录产物溶液在滤纸上流动上升的高度，然后根据预先构建的表征产物溶液在滤纸上流动上升高度与目标mirna浓度之间关系的标准曲线计算得到待测样本中的目标mirna浓度；

3、其中，模板链在dna聚合酶的作用下形成双链，待测样本中的目标mirna能够与模板链上的互补序列结合，竞争性地释放出所形成的双链上的连接链l1，连接链l1与反应体系中的连接链l2链杂交形成不完全互补配对的双链dna，通过该dna的5’末端与3’末端单链区域与y型dna末端单链区域进行杂交，最终形成具有三维网络结构的dna水凝胶；该dna水凝胶的形成使反应体系的粘度提高，从而使得产物溶液在滤纸上流动上升的高度下降，且该高度的大小与待测样本中的目标mirna的浓度对数值呈线性关系。

4、优选的是，所述y型dna通过以下方法制备得到：将dna链a、dna链b、dna链c分别用tris-hcl缓冲液稀释制备成溶液，然后混合反应，反应结束后得到y型dna。

5、优选的是，其中，连接链l1上具有与连接链l2上的第一部分序列相同的序列以及与连接链l2上的第二部分序列互补的序列，l1、l2能杂交形成一段具有5’、3’黏性末端的双链dna；

6、dna链a由一段与l1、l2的黏性末端互补的序列、一段与dna链b互补的序列和一段与dna链c互补的序列组成，dna链b由一段与l1、l2的黏性末端互补的序列、一段与dna链c互补的序列和一段与dna链a互补的序列组成，dna链c由一段与l1、l2的黏性末端互补的序列、一段与dna链a互补的序列和一段与dna链b互补的序列组成；

7、dna链a、dna链b、dna链c杂交形成具有黏性末端的y型dna，一段l1、l2杂交形成的双链dna连接两个y型dna的黏性末端，而一个y型dna的三个黏性末端则分别与其他三个y型dna相连，最终形成dna水凝胶的三维网络结构。

8、优选的是，dna链a、dna链b、dna链c的序列依次如seq id no:1-3所示，连接链l1、连接链l2、模板链、目标mirna的序列依次如seq id no:4-7所示，具体如下：

9、seq id no:1：

10、cgattgactctccacgctgtcctaaccatgaccgtcgaag；

11、seq id no:2：

12、cgattgactctccttcgacggtcatgtactagatcagagg；

13、seq id no:3：

14、cgattgactctccctctgatctagtagttaggacagcgtg；

15、seq id no:4：

16、gagagtcaatcgtctattcgcatgagaattccattcaccgtaag

17、seq id no:5：

18、gagagtcaatcgcttacggtgaatggaattctcatgcgaataga

19、seq id no:6：

20、cttacggtgaatggaattcttgcgaatagacgattgactctcctcagcaactatacaacctactacctca

21、seq id no:7：

22、ugagguaguagguuguauaguu。

23、优选的是，所述y型dna通过以下方法制备得到：将dna链a、dna链b、dna链c分别用tris-hcl缓冲液稀释制备成浓度相同的溶液，然后等体积，95℃反应5min，然后在室温下反应2h，反应结束后得到y型dna。

24、优选的是，标准曲线的构建方法包括以下步骤：

25、配制一系列具有浓度梯度的目标mirna标准溶液，将标准溶液加入含有模板链和dna聚合酶、切刻内切酶的反应体系中，反应后再加入连接链l2和预先制备的y型dna，反应后所得产物溶液转移至样品池内，记录时间t内，产物溶液在滤纸上流动上升的高度，然后以目标mirna的浓度对数值作为横坐标、高度作为纵坐标，拟合得到标准曲线。

26、优选的是，将待测样本加入含有模板链、dna聚合酶、切刻内切酶的反应体系中，反应60-120min后再加入连接链l2和预先制备的y型dna，37℃下反应30-90min，所得产物溶液转移至样品池内，记录时间t内产物溶液在滤纸上流动上升的高度，然后根据标准曲线计算得到待测样本中的目标mirna浓度。

27、优选的是，标准曲线的构建方法包括以下步骤：

28、配制一系列具有浓度梯度的目标mirna标准溶液，将标准溶液加入含有模板链、dna聚合酶、切刻内切酶的反应体系中，反应60-120min后再加入连接链l2和预先制备的y型dna，37℃下反应30-90min，所得产物溶液转移至样品池内，记录时间t内，产物溶液在滤纸上流动上升的高度，然后以目标mirna的浓度对数值作为横坐标、高度作为纵坐标，拟合得到标准曲线。

29、优选的是，所述的基于dna水凝胶垂直纸基传感器的mirna检测方法为：将待测样本与模板链混合，然后加入klenow片段和nb.bbvci切刻内切酶，反应90min后，加入连接链l2和预先制备的y型dna，37℃下反应60min，所得产物溶液转移至样品池内，记录10min内产物溶液在滤纸上流动上升的高度，然后根据标准曲线计算得到待测样本中的目标mirna浓度。

30、本发明还提供一种基于dna水凝胶的垂直纸基传感器，其包括滤纸和反应检测液，所述反应检测液包括如上所述的模板链、连接链l2、y型dna、dna聚合酶和切刻内切酶；该传感器采用如上所述的方法进行mirna的检测。

31、本发明的有益效果是：

32、本发明提出了一种基于dna水凝胶的垂直纸基传感器以及基于该传感器的mirna检测方法，靶标mirna与模板链结合后释放出大量的连接链l1，l1参与形成dna水凝胶并产生溶液粘度的显著上升，在垂直纸基传感器上产生“停止流动”效果，产生明显的流动距离变化，根据该流动距离变化能够计算得到靶标mirna的浓度；以let-7a为例，本发明检测范围为10fm-10nm，检测限为3fm，并对同家族的let-7b等错配序列有良好的区分能力；

33、本发明能解决现有mirna检测方案中预处理程序复杂、灵敏度和准确性不高、检测时间长的问题，本发明的纸基传感器制备简单、成本低，对裁剪精度要求不高，适合于大量制备，能够实现靶标mirna的快速灵敏检测，具有很好的市场应用前景；

34、本发明中用作传感器基材的滤纸是最普遍和最便宜的材料之一，提供了价格低廉的生物检测平台，且具有一次性、免电源样品运输和白色背景等优点；本发明通过直接裁剪的方式获得纸基传感器，无需对基底进行疏水处理或打印疏水图案，简单低成本易操作；

35、本发明的垂直传感器通过重力和粘度两种因素的作用，增加了dna水凝胶形成前后流动距离之差，无需极细的检测区宽度，且检测区宽度在小范围内的变化对垂直传感器的性能影响极小，具有更好的灵敏度和可读性；

36、本发明去除了不必要的纸质样品区，较大的纸质样品区可能会截留大量的分析物，且滤纸表面存在羧基使其总体表面电荷是负的，可能会通过静电相互作用影响分析物的扩散和流动，特别是在分析物带正电荷，或者样品量或浓度很低的情况下，这个问题将更为严重。

37、本发明无需沉积比色试剂，直接通过dna水凝胶的形成或裂解实现流动或停止流动，并且相较于在纸基传感器上沉积比色试剂并耗尽样品的分析方法，本本发明的方法具有更清晰的停止流动边缘，可以提高读数的准确性。