一种基于硅膜法的全集成式核酸检测芯片的制作方法

本发明涉及一种基于硅膜法的全集成式核酸检测芯片，属于微流控芯片。

背景技术：

1、自聚合酶链式反应(pcr)技术问世以来，通过扩增dna来进行基因分析已成为一种普遍的技术。但传统的基于pcr管的扩增装置，由于其自身结构原因所带来的能源损耗高、检测时间长、交叉污染、无法现场实时检测等弊病，传统pcr装置越来越不能满足人们对不同场景应用的需求。

2、伴随着微流控(microfluidics)技术的问世，其集成化、微型化、全封闭、多应用场景等优点受到人们的广泛重视。在过去的十多年里，大量的具有不同结构以及热循环实现方式的微流控芯片被研究出来，并被广泛应用于病原体的检测。微流控检测产品在即时检测(point-of-care testing，poct)场景下的应用优势在世界范围内都得到了充分的体现。

3、传统的微流控芯片主要是采用固化的pdms(聚二甲基硅氧烷)材料来制作，由于其软蚀刻的工艺制备方法，非常适合于实验室的概念创新研究和小批量制作。但这一生产工艺并不适合于大规模生产，尤其是自动化的规模生产。同时，作为一种橡胶材料，用其制作体外诊断(in-vitro diagnostic，ivd)检测产品也较难以为业界所接受。

4、cn2022109249601公开了一种基于柔性薄膜制成的微流控芯片，该芯片可用于细胞裂解以及核酸提取，其通过第一柔性薄膜和第二柔性薄膜相叠合，在薄膜之间设置互相连通的多个功能腔室，各腔室之间可设置微流体通道，通过短小的微流通道获得高速液流提升裂解效果，并利用磁珠实现核酸提取。

5、cn2008801038390公开了一种用于核酸扩增的基于柔性片制成的多腔室容器，其采用磁珠法进行核酸的提取和洗脱，为了便于磁珠或流体在腔室之间高效流动，各腔室之间以尽可能短的距离直接连接或者通过阀门结构连接。

6、cn2022110178734公开了一种用于核酸扩增的基于柔性薄膜的微流控芯片，该微流控芯片包括复合膜、固定结合区、多个功能腔室、一次性阀门和阻液阻气流体通道等；在所述功能腔室及阻液阻气流体通道内第一柔性薄膜与第二柔性薄膜在压力作用下可在相互分离和相互贴合两种状态之间切换。当所述阻液阻气流体通道内的第一柔性薄膜与第二柔性薄膜相互分离并形成流体通道时，所述流体通道允许液体通过但会阻止液体中的孤立气泡。

7、磁珠法是目前应用最为广泛的核酸提取方法。通常使用磁珠的核心由微小(20至30纳米)的磁性氧化铁如四氧化三铁(fe304)组成。他们与一般磁性材料的不同之处在于这些颗粒的微小尺寸使它们具有超顺磁性。它们只有在强磁场的作用下，才会趋向磁场的一极。而在磁场之外则不会相互吸引，从而有效避免了因磁珠聚集而造成的结团。这一特性使得磁珠材料成为在复杂检测样本中用表面化学进行大分子分离或表面特异吸附的理想材料。不同的表面修饰所形成的化学成分使得磁珠法广泛用于体外检测，基因测序，环境保护和食品安全领域的核酸、蛋白质或其他生物分子的分离和纯化。当用于核酸吸附时，磁珠的表面通常覆盖的是二氧化硅(sio2)分子。在适当的盐离子浓度，ph值和核酸结合液的作用下，磁珠可以高效吸附反应体系中的核酸大分子并在强磁场的作用下聚集在反应器的特定位置，以便将反应体系中的废液排出。这样便可以在核酸提取过程中，反复多次地实现磁珠富集和释放，洗去非特异性吸附在磁珠表面的杂质，将洗脱后得到纯化的核酸模板。

8、当把上述磁珠法提取核酸的流程拓展应用于poct场景的微流控器件时，由于检测器件的高度集成、流体结构的微小尺寸和近于苛刻的成本控制要求，耗材核酸提取部分的结构设计、制造工艺和与控制器的配合方式都面临着的巨大挑战。

9、另一种广为使用，但普适性受到较多限制的核酸提取方法是硅膜离心柱(spincolumn)法。与磁珠法相同，用硅膜离心柱法提取核酸时，将核酸从液体中吸附出来的物质也是sio2。其过程也是利用不同盐离子浓度和ph值的情况下实现对dna的结合和释放，来完成核酸的提取和纯化。用硅膜离心柱法提取核酸的一个基本条件是在离心力的作用下，反应溶液经过硅膜后进入废液容器内，以实现样本核酸与sio2物质的充分接触，完成核酸的吸附过程。显然，在使用这一方法时，提取液以及后续需要用到的漂洗液、洗脱液都会以垂直于硅膜平面的方式在离心力的作用下均匀通过硅膜，达到高效快速实现核酸提取的目的。

10、硅膜离心柱法的另一种实施方式是用真空吸力代替离心力。采用这种方式时，通常会将多个硅膜离心柱密封放置于有多个出口的真空腔室上。加入样本或相应试剂之后，对真空腔室引入负压。在负压的作用下，硅膜离心柱内的液体会流过硅膜进入真空腔室以达到核酸的吸附和漂洗的目的。

11、这种通过方式下，硅膜的吸附梯度和其厚度成反比，由于膜的厚度通常可以很薄，因此吸附工作面很大，而梯度降低很小，吸附效率很高。如何在封闭的二维柔性薄膜微流控芯片中，基于硅膜法实现核酸吸附，漂洗和洗脱，并完成核酸检测存在难点，如果将硅膜固定在柔性薄膜微流控芯片的通道中，并顺续通过有适当盐离子浓度的样本溶液，漂洗液和洗脱液，从原理上来讲，是可以实现复杂样本中核酸的提取与纯化的。但在实施时，一方面，因为柔性薄膜微流控芯片为二维平面结构，嵌入硅膜的微流控通道虽然有一定的厚度，但其横截面的尺寸远小于硅膜离心柱常规使用时的平面横截面尺寸，在这种情况下，为了能把样本中的核酸充分吸附在硅膜上，当流体沿微流控通道流经核酸提取硅膜时，装载有硅膜的流道长度要远远大于使用离心柱法时液体所流经的硅膜厚度，过程中所产生的液体流动阻力也会随着流经硅膜液体量的增加而变大。而另一方面，薄膜微流控芯片无论是使用的材料还是制备方式都决定了器件本身的柔韧性是有一定限度的，在持续不断和增加的压力作用下，微通道有可能形成破坏性的形变，从而导致失败的实验结果。因此，现有技术的离心柱硅膜法是无法直接应用于薄膜微流控芯片上的。

12、另一方面，在核酸提取过程中，唾液样本需要经过细胞裂解和结合、核酸的吸附和纯化、以及核酸的洗脱和收集等几个步骤；在核酸检测过程中，经过提取后的核酸样本需要经过与pcr反应液混合、qpcr扩增等步骤。

13、例如，现有技术中公开的专利文件cn202211170669.6，提出了一种一体化核酸提取微流控芯片盒和核酸提取及检测方法，其中，一体化核酸提取微流控芯片盒包括微流控芯片主体、驱动组件及反应组件，微流控芯片主体包括多个可相互连通的腔体、控制腔体与腔体之间导通或截断的阀体、用于驱动液体在各个腔室内流动的驱动组件；使用该一体化核酸提取微流控芯片盒进行核酸提取及检测的方法包括：加样、裂解、核酸捕获、清洗、洗脱、pcr混合、pcr扩增等步骤。

14、但是，该现有技术，在洗脱、pcr混合、pcr扩增等步骤中，核酸首先被洗脱并与洗脱液混合，混有核酸的洗脱液再与pcr反应试剂进行混合，然后对pcr反应腔进行加热扩增以及光学检测，从而完成核酸检测；而将混有核酸的洗脱液与pcr反应试剂进行混合的过程中，混有核酸的洗脱液不能定量，而这容易导致核酸检测失败或核酸检测的结果不准确；例如，理论上与pcr反应试剂的计量相对应的、包含核酸的洗脱液的计量，被定义为预定计量，若与pcr反应试剂相互反应的洗脱液的计量大于预定计量，则容易导致核酸定量结果，相比于实际结果偏高，反之，若与pcr反应试剂相互反应的洗脱液的计量小于预定计量，则容易导致核酸定量结果相比于实际结果偏低。

技术实现思路

1、针对现有技术的中的以上问题，发明的主要目的在于提供一种柔性薄膜微流控芯片及全集成式的定量核酸检测方法，该方法可基于硅膜法实现核酸提取，并可以简便高效地实现核酸洗脱液的定量，以及实时pcr扩增检测实现核酸提取、核酸定量、pcr扩增、荧光检测全流程芯片内完成，从而拓展现有微流控技术的应用。

2、本发明通过以下技术方案实现：

3、一种柔性薄膜微流控芯片，其包括层叠膜、至少一固定结合区、多个功能腔室、流体通道、至少一阀门区和至少一个进液接口，固定结合区、功能腔室、流体通道、和阀门区均分布在层叠膜内，且功能腔室、流体通道的大小和形状由固定结合区的边界定义，进液接口与至少一个功能腔室连接，并在进液后封闭；阀门区可选的设置在功能腔室和流体通道之间，阀门区内分布有不可逆的一次性阀门结构；

4、层叠膜包括层叠设置的第一薄膜和第二薄膜，第一薄膜和第二薄膜中的至少一者为柔性膜；在固定结合区内第一薄膜与第二薄膜不可逆地结合；

5、功能腔室的第一薄膜与第二薄膜在压力作用下可在相互分离和相互贴合两种状态之间切换，当功能腔室内的第一薄膜与第二薄膜相互分离时，功能腔室能容纳流体；

6、流体通道的第一薄膜与第二薄膜在压力作用下可在相互分离和相互贴合两种状态之间切换，当流体在压力作用下从功能腔室内流出时，流体通道的第一薄膜与第二薄膜在流体压力的作用下相互分离，流体通过流体通道从一个功能腔室进入另一个功能腔室；

7、所述柔性薄膜微流控芯片至少包括三个依次相连的功能区：核酸提取区、核酸定量区和核酸检测区，核酸定量区位于核酸提取区和核酸检测区之间；任一个功能区包括至少一个功能腔室；

8、核酸定量区内的功能腔室，至少包括核酸定量室和核酸定量辅助腔室，所述核酸定量室两端分别连接核酸提取区和核酸检测区的功能腔室，核酸提取液由核酸提取区向核酸检测区流动的过程中，依次流入核酸定量室和核酸定量辅助腔室内，将核酸定量室充满后，超过核酸定量室容纳范围的提取液流入核酸定量辅助腔室。

9、本发明核酸定量的原理为：核酸定量池的进口与出口的压强差设为△p，该值决定了核酸定量池的第一、第二薄膜分开的体积。当△p为一固定值且大于柔性薄膜的纵向弹性变形力时，第一、第二柔性薄膜被分开，且分开的体积为一固定体积，此时的体积即为该条件下的定量体积。

10、△p的大小由进口与出口的压强差决定，出口处的压强差是由出口的沟道结构决定的，为一固定值。进口处的压强可通过调整挤压第二洗脱液池的力的大小来调节，当用较大力来挤压第二洗脱液池时，核酸定量池进口处的压强增大，导致△p值变大，此时的定量体积就较大。相反，当用较小力来挤压第二洗脱液池时，核酸定量池进口处的压强减小，导致△p值变小，此时的定量体积就较小。

11、这样就可以实现在不改变定量池结构的情况下，实现不同定量体积的应用需求。

12、进一步的，核酸提取区包括至少一个硅膜室；硅膜室用于捕获液体内的核酸；

13、硅膜室的最大宽度大于流体通道的宽度，其中平铺容纳有与之形状匹配的硅膜；

14、所述核酸提取区的功能腔室通过流体通道与硅膜室相连，所述流体通道可使流体低速可控地从中通过。

15、进一步的，核酸提取区内的功能腔室包括至少一个样本室、至少一个漂洗液室、至少一个废液室和至少二个洗脱液室，所述二个洗脱液腔室分别为第一洗脱液腔室和第二洗脱液腔室，所述核酸定量室经由一次性阀门和第二洗脱液腔室相连。

16、进一步的，核酸提取区内的功能腔室包括一个样本室、二个漂洗液室、一个废液室和二个洗脱液室，所述二个漂洗液腔室分别为第一漂洗液腔室和第二漂洗液腔室。

17、进一步的，核酸提取区内的流体通道以硅膜室为分割点，根据与其相连的功能腔室可以分为多个区段，所述多个区段至少包括第一流体通道和第二流体通道，其中第一流体通道与样本室相连，第二流体通道与废液室相连。

18、进一步的，核酸提取区内的功能腔室还包括至少一个裂解液室、至少一个结合液室，裂解液室位于样本室和结合液室之间，并分别经由一次性阀门与样本室和结合液室相连，进液接口与样本室相连。

19、功能腔室通过流体通道与硅膜室的连接方式在此不做限制，功能腔室可以各自独立地通过流体通道直接和硅膜室连接，然而，这种连接方式并不优选，因为硅膜室很小，难以提供足够的空间与各个流体通道对接，这也会限制流体通道的尺寸。

20、进一步的，核酸提取区内的功能腔室通过共用一部分流体通道的方式与硅膜室连接，与硅膜室直接连接的流体通道不多于5条、4条、3条或2条。

21、进一步的，核酸提取区内所述功能腔室通过共用第一流体通道和/或第二流体通道的方式与硅膜室连接，与第一流体通道和/或第二流体通道直接连接的流体通道不少于5条、4条、3条、2条或1条。

22、进一步的，核酸提取区内所述样本室经由一次性阀门通过第一流体通道与硅膜室连接，废液室通过第二流体通道与硅膜室连接，其余各功能腔室通过各自流体通道与第一或第二流体通道连接。

23、进一步的，所述漂洗液腔室经由一次性阀门和第一流体通道连接；第一洗脱液腔室经由或不经由一次性阀门和第二流体通道连接，第二洗脱液腔室经由或不经由一次性阀门和第一流体通道连接，或者，第一洗脱液腔室经由或不经由一次性阀门和第一流体通道连接，第二洗脱液腔室经由或不经由一次性阀门和第二流体通道连接。

24、进一步的，核酸检测区内的功能腔室包括至少一个pcr反应液室、至少一个pcr扩增腔室，其中，pcr反应液室经由或不经由一次性阀门分别与pcr扩增腔室和核酸定量室相连。

25、进一步的，pcr反应液室、核酸定量辅助腔室通过共用一部分流体通道的方式与核酸定量室相连通。

26、进一步的，所述pcr反应液室为两个，分别为第一pcr反应液室和第二pcr反应液室，所述第一pcr反应液室经由一次性阀门和第二pcr反应液室相连，所述第二pcr反应液室经由或不经由一次性阀门分别与pcr扩增腔室和核酸定量室相连。

27、进一步的，所述pcr扩增腔室为一个以上，分别通过流体通道和pcr反应液室相连。

28、进一步的，裂解液腔室和样本腔室直接连接，和/或裂解液腔室和结合液腔室直接连接，和/或第二洗脱液腔室与核酸定量腔室直接连接，和/或核酸定量与核酸定量辅助腔室和第二pcr反应液腔室直接连接，和/或第一pcr反应液室与第二pcr反应液室直接连接，和/或第二pcr反应液室与pcr扩增腔室直接相连。

29、流体通道使液体低速可控流动是实现本发明硅膜法吸附、洗脱的关键，较低的速度使流经硅膜的液体与硅膜有充分的吸附和洗脱时间，从而最大限度减小吸附和洗脱的梯度下降程度，使硅膜充分吸附液体中的核酸以及被洗脱液充分洗脱，达到和液体垂直经过硅膜类似的效果。

30、本发明所述的低速可控流动，指的是液体在流体通道中，以低于45u l/s，优选低于40u l/s、30u l/s、20u l/s、15u l/s、10u l/s、5u l/s的平均流速流动。

31、本技术人的在先专利cn2022109249601的微流控芯片中，各腔室之间同样可设置微流通道，并限定了其通道的宽度为0.1-10mm，长度为0.1mm-50mm，并记载液体以高速(5-20m/s)通过微流通道以提升细胞等物质的裂解效果，液体在微流通道中高速流动显然不能适用于本发明。申请人进一步的研究发现，不同结构的流体通道，对于液体流速的影响是不同的，具体地讲，通道中液体流速和以下几个因素相关：

32、a.流体通道被液体撑开后，流体通道薄膜和微流控芯片平面之间的最大夹角；

33、b.流体通道的宽度；

34、c.流体通道的长度。

35、当施加正压挤压储液腔室后，腔室内的液体获得一定的液体压力，从而驱使液体开始流动。由于流体通道在流体经过之前是贴合状态，流体流出储液腔室进入流体通道后，需要克服薄膜的张力撑开流体通道：

36、第一、流体通道撑开后，流体通道薄膜和微流控芯片平面之间的最大夹角越小，则表示在薄膜弹性模量不变的情况下，将该流体通道撑开所需的液压越大，意味着需要克服的阻力越大，所述最大夹角的大小通常和薄膜材料的硬度相关，而硬度则和弹性模量以及厚度相关，一般来讲，弹性模量越大，则最大夹角越小，弹性模量越小，则最大夹角越大。

37、第二、流体通道的宽度越小，则通道撑开后的横截面积越小，横截面上的液压同样也越大，需要克服的阻力也越大。

38、第三、流体通道的长度越长，则整个流体通道给与的阻力也相应越大。

39、本技术人的在先专利cn2022109249601的微流控芯片中，实际采用的微流通道十分短小，偏向于长度范围的下限，在较大液压的驱动下，液体可以在通道中高速通过，显然，这并非本发明所期望的。

40、本发明可以在膜材料选择，流体通道宽度及长度设置上进行选择搭配，使得液体在流体通道中的流速符合上述定义，即可用作本发明的使液体低速可控流动的流体通道。

41、本发明中，使用常见的柔性薄膜时(弹性模量400-6000mpa，厚度0.05-2mm)，为了匹配实际的产品尺寸，可以设置的沟道长度为5-150mm，优选20-100mm，在上述尺寸下，沟通的宽度可以为0.5-2mm，优选1.3-1.8mm，需要说明的是，上述尺寸并非对本发明流体通道结构的限制，仅仅是提供了可以实施的范围，并不限制在该范围外实现的可能，只要能够实现本发明所述的低速可控的效果即可。

42、从以上描述中可知，本发明所述的流体通道在使用时，流体在通道内所受到的阻力是动态可变的。用现有技术实现预灌装于薄膜微流控芯片储液腔室内的液体以重复可控的缓慢匀速的方式在微通道内流动是非常困难的。采用机械挤压时，因为每次灌装时封装在储液腔室内的空气量不同，灌装后腔室的总体积会不一样。导致同样的挤压速度会产生不同的挤压效果。另外，腔室的异形也导致因驱动液体腔室厚度变化时，液体在通道内的流速会有明显的不同甚至在不同位置出现焊接部位的撕裂情况。

43、本发明的方案中，施加正压挤压储液腔室后，腔室内的液体获得一定的液体压力，从而驱使液体开始流动。由于细长的流体通道在流体经过之前是贴合状态，流体流出储液腔室进入流体通道后，需要克服阻力撑开流体通道，而且，当流体通道的柔性薄膜被撑开后，由于通道部分的薄膜非常窄小，薄膜被撑开产生形变后便会对流体产生因较大的压力而导致的流动阻力。因此，流体一直需要克服阻力流动，在流体通道内的流速缓慢，随着液体从储液腔室中流出，在挤压装置未增大挤压行程的情况下，压力得到释放，当压力释放完毕或者压力的大小不足以驱动液体流出，则液体会停止流动，因此，需要挤压装置对腔室持续保持恒定的压力，使液体匀速流动，或者间断性地增大挤压行程挤压腔室，使液体波段性地流动。以间断性挤压为例，比如采用脉冲的挤压方式，第一次向腔室施加一个压力，液体产生内压力，液体开始流动，但由于狭窄闭合流体通道的存在，液体流出的很慢，因此，液体内压力释放的也很慢。当液体内压力释放到一定值以后(比如无法驱动液体流出狭窄流体通道时)，由于挤压装置未增大挤压行程，随着腔室体积变小，挤压装置和腔室侧壁没有力的接触或者相互间作用力较弱；此时，增大挤压行程，第二次施加压力，继续让液体保持内压力，使得液体可以继续缓慢的流出狭窄流体通道。如此循环，则液体可以间断性地保持缓慢的速度流出狭窄的流体通道。当间断性挤压的间隔不断缩小，则实质上变成持续性挤压的方式。

44、功能腔室和流体通道之间根据需要设置阀门区，所述的需要包括，所述功能腔室需要预装液体。需要所述阀门区内分布有不可逆的一次性阀门结构，当所述一次性阀门结构例如因流体压力被从关闭状态改变为打开状态时，流体可在压力作用下从所述功能腔室进入流体通道或者从流体通道进入所述功能腔室；

45、本发明还提供一种流体样本处理装置，其包括：

46、如前所述的柔性薄膜微流控芯片。

47、进一步的，所述流体样本处理装置还包括若干物理阀门，所述物理阀门用于可重复地、以物理方式控制不具有一次性阀门的流体通道的开闭或在一次性阀门打开后，可重复地以物理方式继续控制该一次性阀门所对应的流体通道的开闭，

48、进一步的，还包括一个以上第一挤压机构，每一第一挤压机构的位置及其几何形状对应一个功能腔室设置，并用于选择性地对相应功能腔室施加压力，以打开一次性阀门或驱使流体流入流体通道并流向所需的位置。

49、进一步的，所述物理阀门包括一个以上第二挤压机构，每一第二挤压机构对应所述微流控腔室的一个阀门区设置，并用于选择性地对相应阀门区施加压力，以使相应的阀门开启或关闭。

50、与压力控制机构相配合，使用一种特殊控制时序来调节气源电磁阀的开关方式和时间，以达到对相应功能腔室缓慢施加波段式压力的目的。

51、本发明还提供如前所述的流体样本处理装置在流体样本处理上的用途。

52、进一步的，所述用途为在核酸提取或核酸pcr扩增检测中的用途。

53、本发明还提供一种核酸pcr扩增检测方法，所述方法基于如前所述流体样本处理装置实施，其包括如下步骤：

54、s1、核酸提取：核酸样本经过核酸提取区后获得符合检测标准的核酸洗脱液，并存放在与核酸定量区相连的功能腔室中；

55、此处的样本是目标核酸，需要溶解或者渗透细胞以首先释放目标核酸并且使其可以用于扩增检测。如果细胞被溶解，那么溶解产物所含有的物质除了核酸之外还包括：细胞器、蛋白质(包括诸如蛋白酶和核酸酶的酶)、碳水化合物，以及脂类，这需要进一步净化并提取核酸。样本需要在装载到本发明的流体样本处理装置之前，将这些细胞裂解，或者在装载到本发明的流体样本处理装置后，在样本室完成细胞组织的裂解，例如和裂解液一起装入样本室。细胞可以由通过本领域技术人员熟知的各种方法来裂解，包括化学方法、机械方法(例如，超声)和/或热方法。

56、s2、核酸洗脱液定量：

57、调整物理阀门，只开放核酸定量腔室与存放核酸洗脱液的腔室、核酸定量辅助腔室之间的液体通路并以设定挤压力挤压存放核酸洗脱液的腔室，使核酸洗脱液通过流体通道流经核酸定量腔室流入核酸定量辅助腔室，此时核酸定量腔室为充满状态并容纳所需量的核酸洗脱液；

58、调整物理阀门，只开放核酸检测区与核酸定量腔室相连的腔室和核酸定量腔室的液体通路并以设定挤压力挤压充满核酸洗脱液的核酸定量腔室，使核酸洗脱液通过流体通道流入核酸检测区与核酸定量腔室相连的腔室；

59、s3、pcr扩增检测：在核酸检测区中，将pcr反应液扩增并检测，得到检测结果。

60、进一步的，所述s1步骤包括如下步骤：

61、s1a、试剂灌装及加样步骤：

62、向微流控芯片的裂解液腔室内注入裂解液，向结合液腔室内注入核酸结合液，样本腔室内注入蛋白酶，向漂洗液腔室内注入漂洗液、向第一洗脱液腔室和第二洗脱液腔室中的至少一个内注入洗脱液，向样本室内注入未裂解的核酸样本，选自组织研磨液、样本保存液、血浆或血清；

63、s1b、样本裂解步骤：

64、调整物理阀门，只开放裂解液腔室与样本室的通路，以设定挤压力挤压裂解液腔室，打开一次性阀门并通过裂解液腔室与样本腔室之间的对挤实现裂解液、样本和蛋白酶之间的液体混合和样本裂解，获得样本反应液；

65、样本裂解完成后，开放结合液腔室与裂解液腔室之间的通路并以设定挤压力挤压核酸结合液腔室，打开一次性阀门，将核酸结合液挤入已裂解的样本反应液以实现样本反应液和核酸结合液之间的混合。

66、s1 c、核酸捕获步骤：调整物理阀门，只开放样本室经硅膜室至废液室的通路，以设定挤压力挤压样本室，使液态样本打开一次性阀门并通过流体通道流经硅膜室再排入废液室，完成核酸捕获；

67、s1 d、核酸漂洗步骤：调整物理阀门，只开放漂洗液腔室经硅膜室至废液室的通路，并以设定挤压力挤压漂洗液腔室，使漂洗液通过流体通道流经硅膜室再排入废液室，完成核酸漂洗；

68、s1 e、核酸洗脱步骤：

69、调整物理阀门，只开放第一洗脱液腔室、第二洗脱液腔室经硅膜室的通路，以设定挤压力挤压加注有洗脱液的洗脱液腔室，使洗脱液通过流体通道流经硅膜室流入另一洗脱液腔室，之后以设定挤压力交替挤压两个洗脱液腔室，直至吸附在硅膜上的核酸被完全洗脱，携带核酸的洗脱液最终存放在与核酸定量区相连的洗脱液腔室中，完成核酸提取。

70、进一步的，所述s1步骤还包括如下步骤：

71、s1 f、试剂灌装及装样步骤：向第一pcr反应液腔室内注入pcr反应液；

72、所述s3步骤包括如下步骤：

73、s3a、pcr扩增液混合：定量的核酸洗脱液流入第二pcr反应液腔室后，调整物理阀门，只开放第一pcr反应液腔室与第二pcr反应液腔室的通路，交替对挤第一pcr反应液腔室和第二pcr反应液腔室，实现核酸洗脱液与pcr反应液的混合，含有核酸洗脱液的pcr混合液保存在第二pcr反应液腔室中；

74、s3b、pcr扩增检测：调整物理阀门，只开放第二pcr反应液腔室与pcr反应腔室的通路并以设定挤压力挤压第二pcr反应液腔室，使存放在腔室中的pcr混合液转移到pcr反应腔室中；对pcr反应腔室加载预设的pcr升降温程序，并在设定的温度点进行荧光采集，完成核酸检测。

75、相比于现有技术，本发明的优点在于：

76、1、在本发明中，核酸提取捕获区包括具有洗脱功能的洗脱液，核酸检测区即用于进行pcr反应的检测区，液体由核酸提取捕获区向核酸检测区流动的过程中，需暂存入核酸定量室内并将核酸定量室充满，以此达到获得定量的与pcr反应试剂进行混合的液体。本发明利用压差和定量室的柔性薄膜实现洗脱液定量，该定量体积可以在一定范围内根据需要而变化。

77、2、本发明的微流控芯片在封闭的二维平面柔性薄膜微流控芯片中，实现了基于硅膜法的核酸提取以及扩增检测。

78、3、本发明的柔性薄膜微流控芯片中设置流体通道，该流体通道除了连接各功能腔室和硅膜室形成液体通路，还能为硅膜室的设置提供空间，硅膜室相当于设置在一条流体通道上，其他各功能腔室各自通过流体通道与设置有硅膜室的流体通道相连或者与硅膜室直接相连。硅膜室需要尽可能小的膨胀形变，其投影面积远小于各功能腔室，硅膜法中各液路分批流经硅膜室的液体种类较多，因此硅膜室实际上成为核心室，现有技术中，各功能腔室直接或者以很短的连接通道相连，现有技术的连接方式无法实现各功能腔室和较小的硅膜室以可靠的方式连接以及通过物理阀门或者其他手段随意切换流经硅膜室的液体通路，更无法保证液体通路切换后，各液体之间由于残留或者快速震动或加样枪的运动而导致的交叉污染的可能性。

79、4、在两个腔室之间设置可开合柔性细长流体通道，利用细长通道的开合张力以及长行程的持续阻力，实现腔室之间液体定量可控低速流动，实现了在二维平面中，使硅膜能充分吸附和洗脱核酸等待检测物，并解决了pcr扩增实验中，定量获取扩增核酸的技术问题。