一株解淀粉芽孢杆菌MLY71及其应用的制作方法

本发明涉及农用生物防治菌剂领域，主要是涉及一株增殖速度慢，可连续组成型和诱导型合成泛革素(fengycin)的解淀粉芽孢杆菌突变株mly71及其应用。

背景技术：

1、解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)是通过美国食品和药物管理局安全认证的菌种，在中国也属微生物肥料使用的免检菌种，广泛分布于动植物表面、土壤、地表淡水、空气、海洋及水底污泥等之中。解淀粉芽孢杆菌在生物肥料、畜牧养殖、食品加工与防腐、农业生产、环境保护等多个工农业领域均有广泛应用。

2、在农业生产方面，解淀粉芽孢杆菌在植物病害防护、果蔬保鲜、植物生长促进、增强作物抗逆性、改善土壤微生态等领域均有突出表现。其中，解淀粉芽孢杆菌也是产生抑菌物质的一大群体，常见抑菌物质包括：表面活性素(surfactin)、枯草素(iturin)、泛革素(fengycin)、聚酮类化合物、环肽类、铁载体等。在常见解淀粉芽孢杆菌工程育种中，生长速度快，即增殖加倍所需时间短，是菌株筛选依据中的一个重要指标。相反生长速度慢，即增殖加倍所需时间长，通常是不利指标。除优良菌株选育之外，优选菌株的高效配套发酵工艺也是获得环脂肽类抑菌物质大量累积的重要技术支撑。研究表明，添加适当纳米材料、正十四烷、果糖以及制造氧化应激等方法可以提高芽孢杆菌发酵产环脂肽类抑菌物质的水平。环脂肽类抑菌物质的分离方法则以硫酸铵沉淀、有机溶剂萃取法、酸沉淀法以及凝胶柱层析法等为常见。

3、解淀粉芽孢杆菌产泛革素(fengycin)研究报道已见多例，相关功能基因也已经较为明确。在解淀粉芽孢杆菌产生众多具有抑菌活性的代谢产物中，环脂肽类代谢产物的合成时期主要是平台期，如泛革素(fengycin)的累积就是发生在平台期。泛革素(fengycin)的结构主要包含一个由10个氨基酸所组成的环肽和一条脂肪酸链，经由非核糖体合成途径合成。在以往报道中，较多提及枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌合成泛革素的研究。解淀粉芽孢杆菌合成泛革素研究多参考枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌相关文献。研究表明泛革素(fengycin)的合成为诱导型，且在进入生长曲线的平台期后方才开始合成。

4、本发明所述菌株除保留野生型菌株于平台期诱导合成泛革素能力外，新获得了于生长曲线迟缓期和对数期组成型合成泛革素的能力，但同时细胞增殖速度出现了大幅度降低。高产活性成分的同时，其细胞增释速度大幅减慢殖。慢速增殖的特点使得该菌株(mly71)能够以更少的物质和能量消耗，来维持大田里较长的病害防控时期内(如2个月)的种群活力；同时将更多的将物质和能量消耗用于活性成分，即泛革素的合成。在农业应用中，生长速度慢高产抑菌物质的特性赋予mly71菌株在同等营养物质供应下可以保持更长的活性状态的能力，极大的利于田间防效的延长和保持。

技术实现思路

1、本发明的首要目的是提供一株能够组成型表达高产抗真菌(尤其是烟草疫霉)活性成分-泛革素，且生长速度较慢的解淀粉芽孢杆菌新菌株mly71。解淀粉芽孢杆菌普遍生长速度较快，且到达平台期后才表达泛革素。但是在农田应用中，前期的快速生长对营养物质要求较高，达到平台期后土壤环境下不利于大量积累泛革素，最终会因快速生长导致土壤缺氧情况加剧，因泛革素累积不足导致防病效果不佳。在此情况之下，培育生长速度较慢、能够组成型合成泛革素的解淀粉芽孢杆菌新菌株就具有切实的实际应用意义。

2、一株解淀粉芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)突变株mly71，保藏号为cgmcc no.25976。

3、所述的解淀粉芽孢杆菌突变株mly71，能够组成型和诱导型合成泛革素。

4、所述的解淀粉芽孢杆菌突变株mly71，mly71菌株增殖速度较野生型菌株降低，对数期细胞数量倍增所需时间为2.5h-12.0h。

5、所述的解淀粉芽孢杆菌突变株mly71，mly71菌株对烟草疫霉菌株具有非细胞接触性抑菌活性，平板有效抑制距离1.0-4.2cm。

6、本发明的第二个目的是提供所述的解淀粉芽孢杆菌突变株mly71的应用，用于抑制真菌。

7、进一步地，用于抑制疫霉，尤其是烟草疫霉。

8、本发明的第三个目的是提供所述的解淀粉芽孢杆菌突变株mly71发酵产泛革素培养基，蔗糖5.0-20.0g，十四胺1.0-10.0g，油酸1.0-10.0g，玉米浆粉1.0-10.0g，酪蛋白胨1.0-10.0g，谷朊粉1.0-10.0g，硝酸钠0.1-1.0g，硫酸镁0.1-2.0g，磷酸二氢钾1.0-5.0g，碳酸钙0.1-1.0g，硼酸10-200mg，钼酸钠10-200mg，氯化钴10-200mg，氧化锌10-200mg，氯化铜10-200mg，硫酸亚铁10-200mg，定容至1l。

9、本发明的第四个目的是提供所述的解淀粉芽孢杆菌突变株mly71合成泛革素的分离方法，发酵结束后先将发酵液降温到15℃-25℃，并静置0.5-4h；取静置后分离出的上层白色乳液，加入ph3.5-6.0质量百分比浓度为1.0％-10％的壳聚糖水溶液，搅拌均匀；所述的白色乳液与壳聚糖水溶液体积比5:1-1:5；于2000-8000转/分条件下离心收集沉淀；按沉淀湿重与正丁醇质量比1:0.5-1:5混合，并于45℃-65℃下搅拌萃取0.5h-2h；收集萃取处理后的沉淀，并加入乙醇-碳酸钠水溶液，其中碳酸钠水溶液的浓度为10-100mm，乙醇与碳酸钠水溶液的混合体积比为乙醇：碳酸钠水溶液＝2:8-9:1；萃取处理后的沉淀与乙醇-碳酸钠水溶液的质量比1:1-1:5；反应时间范围0.5-8h；取反应后的乙醇-碳酸钠水溶液经1000道尔顿排阻分子量的透析袋于4-6倍体积的蒸馏水中透析过夜，透析袋内溶液经75-95℃烘干，即为mly71菌株发酵合成的泛革素。

10、本发明提供的解淀粉芽孢杆菌突变株mly71，由从土壤分离的野生型产泛革素解淀粉芽孢杆菌菌株ba01，经co60辐照育种法选育获得；对数期细胞数量倍增所需时间2.5h-12.0h；对烟草疫霉hjb菌株具有非细胞接触性抑菌活性，平板有效抑制距离1.0-4.2cm；能够组成型和诱导型合成泛革素；mly71菌株发酵终产物中进入平台期前后泛革素(fengycin)合成量的比例介于4:1-1:4之间，泛革素(fengycin)合成相关基因fenc表达量前后比值介于0.8-0.1之间，泛革素(fengycin)合成相关调控基因degq表达量前后比值介于0.9-0.2之间。选育过程中，通过挑取小菌落结合拮抗效果评价法筛选组成型高产泛革素，同时慢速生长的特殊解淀粉芽孢杆菌新菌株，反向筛选高产抗真菌活性物质的慢速生长突变株，虽然该筛选策略会因菌种生长缓慢导致工业菌剂制备难度升高，但是能够显著延长菌剂的活力保持时长，延长拮抗烟草疫霉的持效期。

11、本发明有益效果

12、本发明突变株生长缓慢且能组成型合成抗真菌物质泛革素，因此在少量营养物质供应下，即可保持较长的有效抑制病害真菌生长的效果。对于开发同步包埋菌剂和营养物质的高效生防菌剂具有特别突出的有益效果，在植物保护、食品防腐、饲料防霉等方面具有广阔的应用前景。

13、本发明解淀粉芽孢杆菌突变株mly71,分类命名：解淀粉芽孢杆菌，拉丁学名：bacillus amyloliquefaciens mly71，保藏号：cgmcc no.25976，保藏日期：2022年10月28日；保藏单位为：中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址：中国.北京.中国科学院微生物研究所。