一种磷酸富集型化学交联剂及其制备和应用

本发明涉及一种可富集型化学交联剂及其制备方法和应用。本发明交联剂是一种多功能的化学交联剂，具有一个磷酸富集基团、两个琥珀酰亚胺酯基团。为了获得更丰富的交联信息，在分子骨架中引入peg链以改变分子的交联半径并增加分子的柔性，同时，peg链可以增加分子的亲水特性。在生理条件下，本交联剂的磷酸基团带有负电荷，结合peg链的强亲水性，使得本交联剂无法透过细胞膜，因此可以实现细胞表面蛋白质复合体的结构和相互作用分析以及细胞外成分，如分泌蛋白质和细胞外囊泡蛋白质介导的与细胞间通讯相关相互作用分析。

背景技术：

1、蛋白质是生命活动的执行者，蛋白质结构处在动态变化之中且与其功能密切相关。细胞表面蛋白质在细胞粘附、信号转导、物质交换、免疫应答以及细胞通讯等生命活动中起到非常重要的作用。它们是广泛的药物设计靶标，是细胞间通讯的相互识别位点，是重要的疾病诊断、治疗及预后的标志物分子来源，并常用作特定类型细胞分选和分类的标志物分子。通常情况下，多个蛋白质组成复合物发挥其功能。因此，研究细胞表面蛋白质复合物的结构及相互作用对于了解蛋白质功能、解析细胞间信息交流、解释和预测各种生命现象起着至关重要的作用。

2、近年来，化学交联质谱技术(cxms)在研究蛋白质结构及其相互作用领域扮演着重要角色。相比酵母双杂交、免疫共沉淀、核磁共振、x射线衍射等传统技术，化学交联质谱技术具有独特的优势，如适用于复杂的样品体系(亚细胞器、细胞、组织等)、能够捕获瞬时和弱的蛋白质相互作用、解析生理条件下原位动态的蛋白质相互作用等。

3、交联剂常见的功能基团包括琥珀酰亚胺酯(与氨基反应)、马来酰亚胺(与巯基反应)等。其中琥珀酰亚胺酯的反应活性好，应用广泛，可以实现表面蛋白质复合物机构和相互作用分析。交联后的蛋白质样品酶解成肽段，进而采用蛋白质组学由底而上的(bottom-up)策略，实现交联肽的鉴定以及蛋白质结构及相互作用的解析。针对复杂的生物样品，尤其细胞或组织样品，由于蛋白质种类多、丰度跨度大，以及交联反应效率有限，导致酶解后的样品成分复杂，其中交联肽含量极低，因此质谱鉴定极其困难。因此，为了提高交联肽的比例及质谱鉴定的灵敏度，同时降低常规肽段的背景干扰，人们开发多了各种各样的富集型交联剂。生物素-链霉亲和素系统是常见的富集方法。由于生物素基团产生较大反应位阻影响交联反应效率以及交联肽疏水性增强，不利于质谱鉴定；人们又开发了含有炔基(叠氮)的交联剂，虽然这种富集方式已成功应用于细胞蛋白质结构及其相互作用的规模化分析，但仍存在操作步骤繁琐，样品回收率低等问题。

4、固相金属亲和色谱(imac)是利用磷酸基团与固相化的fe3+、ga2+及cu2+等金属离子的亲和来富集磷酸化肽，具有特异性好、结合力强、易于洗脱释放的优点，在磷酸化蛋白质组具有广泛的应用。因此人们在交联剂上结合磷酸基团，实现了更高效的交联肽富集方法。

技术实现思路

1、基于以上研究背景及现状，本发明设计并合成了一种磷酸富集型化学交联剂。本发明交联剂具有磷酸富集单元，交联反应得到的交联肽段含有磷酸基团，适用于基于固相金属亲和色谱(imac)的磷酸化肽富集策略，可大幅降低样品中常规肽段的干扰，进而增强交联肽段在质谱检测中的信号强度，实现交联肽段高灵敏度鉴定，同时磷酸基团增加了交联剂的亲水性，生物兼容性更好；具有两个琥珀酰亚胺酯结构单元。该基团可与蛋白质的赖氨酸残基末端氨基或蛋白质n端氨基发生酰胺化反应，反应条件温和，反应效率高；分子骨架结构引入聚乙二醇(peg)链，可以提高交联剂的亲水性，结合磷酸基团的亲水性，抑制交联剂透过细胞膜引起细胞内蛋白质交联，使其适用于细胞外蛋白质(如细胞表面蛋白质、分泌蛋白质、细胞外囊泡蛋白质)的特异性分析，获得上述蛋白质的结构和相互作用信息。同时，peg可提高交联剂的柔性，并可通过peg链长度的调整，改变交联剂分子的交联半径，有利于捕获更多的蛋白质相互作用信息。本发明交联剂应用于细胞表面蛋白质结构及相互作用分析，同时为实现分泌蛋白、细胞外囊泡介导的细胞间通讯研究提供重要的技术支撑。

2、本发明提供的多功能交联剂，结构如下所示：

3、

4、本发明提供了交联剂的制备方法，具体步骤如下：

5、第一步，以4-(2-羧基乙基)庚二酸(化合物0)为起始原料，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(以下简称edci)为缩合剂，n-羟基琥珀酰亚胺(以下简称nhs)为羟基供体，二氯甲烷(以下简称dcm)为反应溶剂，发生酯化反应制备癸三琥珀酰亚胺酯(化合物1)；反应完毕，经液相分离纯化，得到癸三琥珀酰亚胺酯溶液，经旋转蒸发干燥获得癸三琥珀酰亚胺酯(化合物1)。

6、第二步，以步骤一所得癸三琥珀酰亚胺酯(化合物1)为原料，进行酰胺化反应，加入氨基-peg3-羧酸以及有机碱三乙胺(以下简称tea)，制备三peg3-三羧酸(化合物2)。

7、第三步，以化合物2为反应原料，edci为缩合剂，nhs为羟基供体，dmso为反应溶剂，发生酯化反应，制备三peg3-三琥珀酰亚胺酯(化合物3)。

8、第四步，以化合物3及氨丙基磷酸为原料，摩尔比控制在1：1，tea为有机碱，dmso为反应溶液，发生酰胺化反应，制备pdse(目标交联剂)。

9、本发明中所述的磷酸富集型化学交联剂的合成路线如下：

10、

11、本发明交联剂应用于细胞表面蛋白质结构及相互作用分析，同时为实现分泌蛋白、细胞外囊泡介导的细胞间通讯研究提供重要的技术支撑。

12、与现有化学交联剂相比，本发明交联剂具有如下优点：

13、1.具有磷酸基团。交联反应得到的交联肽段含有磷酸基团，适用于基于固相金属亲和色谱(imac)的磷酸化肽富集策略，可大幅降低样品中常规肽段的干扰，进而增强交联肽段在质谱检测中的信号强度，实现交联肽段高灵敏度鉴定，同时磷酸基团增加了交联剂的亲水性，生物兼容性更好；

14、2.具有两个琥珀酰亚胺酯结构单元。该基团可与蛋白质的赖氨酸残基末端氨基或蛋白质n端氨基发生酰胺化反应，反应条件温和，反应效率高；

15、3.分子骨架结构引入聚乙二醇(peg)链，可以提高交联剂的亲水性，结合磷酸基团的亲水性，抑制交联剂透过细胞膜引起细胞内蛋白质交联，使其适用于细胞外蛋白质(如细胞表面蛋白质、分泌蛋白质、细胞外囊泡蛋白质)的特异性分析，获得上述蛋白质的结构和相互作用信息；

16、4.peg可提高交联剂的柔性，并可通过peg链长度的调整，改变交联剂分子的交联半径，有利于捕获更多的蛋白质相互作用信息。

技术特征：

1.一种磷酸富集型化学交联剂，其化学结构式为：

2.一种权利要求1所述的交联剂的制备方法，其特征在于，具体过程如下：

3.根据权利要求2所述的交联剂的制备方法，其特征在于：步骤一中将反应物化合物0、edci、nhs溶于dcm中，化合物0、edci与nhs摩尔比控制在1：(3.5-4.5)：(3.5-4.5)，反应温度控制在25-30℃，反应时间控制在24-36h；反应完毕，经液相分离纯化，得到癸三琥珀酰亚胺酯溶液，经旋转蒸发干燥获得癸三琥珀酰亚胺酯(化合物1)。

4.根据权利要求2所述的交联剂的制备方法，其特征在于：步骤二中将癸三琥珀酰亚胺酯(化合物1)溶于dmso中，加入相对于化合物03.5-4.5当量的氨基-peg3-羧基，加入相对于化合物010-15当量的tea，继续反应5-30min，反应温度控制在25-30℃；反应完毕，反应液经过柱层析分析纯化，分离填料为200-400目硅胶，流动相为甲醇氯仿混合液，甲醇氯仿体积比控制在1：(2.0-4.0)，除去有机相，得到无色油状液体三peg3-三羧酸(化合物2)。

5.根据权利要求2所述的交联剂的制备方法，其特征在于：步骤三中将化合物2、edci、nhs溶于dmso中，化合物2、edci与nhs摩尔比控制在1：(3.5-4.5)：(3.5-4.5)，反应温度控制在25-30℃，反应时间控制在24-36h；反应完毕，反应液缓慢滴加至相对于反应液5-8倍体积的无水四氢呋喃(thf)，静置12-24h，除去thf，即得到无色油状物三peg3-三琥珀酰亚胺酯(化合物3)。

6.根据权利要求2所述的交联剂的制备方法，其特征在于：步骤四中将化合物3溶于dmso中，加入相对于化合物3的3.0-4.0当量的tea，混合均匀；将相对于化合物3的1.0-1.2当量氨丙基磷酸溶于dmso中，缓慢滴加至反应液，约5-10min滴加完毕。反应温度控制在25-30℃，反应时间控制在5-30min；反应完毕，反应液经半制备液相分离纯化，制备柱为c18填料硅球，直径50mm，长度300mm，流动相分别为水(含0.1-0.5％体积的tfa)、乙腈(含0.1-0.5％体积的tfa)，采用线性梯度：2-4％的水相增加到30-35％的水相，用时40min，收集32-35min流出液，真空冻干，即可得到目标交联剂pdse。

7.一种权利要求1所述的交联剂的应用，其特征在于：可用于细胞质膜蛋白质组学领域，包括细胞质膜蛋白质复合体的规模化分析、细胞质膜蛋白质的三维空间结构解析或细胞质膜蛋白质-蛋白质相互作用解析。

技术总结本发明涉及一种可富集型化学交联剂的制备方法及其应用。本交联剂具有以下功能特点：1)具有磷酸基团，适用于基于固相金属亲和色谱(IMAC)的磷酸化肽富集策略，同时磷酸基团增加了交联剂的亲水性，生物兼容性更好；2)具有两个琥珀酰亚胺酯结构单元，该基团可与蛋白质的赖氨酸残基末端氨基或蛋白质N端氨基发生酰胺化反应，反应条件温和，反应效率高；3)分子骨架结构引入聚乙二醇(PEG)链，可以提高交联剂的亲水性，结合磷酸基团的亲水性，抑制交联剂透过细胞膜引起细胞内蛋白质交联，使其适用于细胞外蛋白质(如细胞表面蛋白质、分泌蛋白质、细胞外囊泡蛋白质)的特异性分析，获得上述蛋白质的结构和相互作用信息。技术研发人员：张丽华,侯国珊,随志刚,高航,江波,陈静,杨开广,张玉奎受保护的技术使用者：中国科学院大连化学物理研究所技术研发日：技术公布日：2024/6/18