编辑核酸序列的方法与流程

发明领域一方面，本发明涉及将目标序列引入靶核酸中的方法。本发明还涉及组装核酸序列的方法，所述方法包括对将目标序列引入靶核酸中的方法进行迭代。

背景技术：

0、发明背景

1、用合成dna替换基因组dna的策略1-12使基因组工程成为可能，并为强大的技术提供了基础，以产生完全合成的基因组，而这单独通过编辑方法是无法产生的。基因组合成已用于产生两种生物体的合成基因组：支原体(1mb)，用于研究基因组最小化13；以及大肠杆菌(4mb)，用于产生重新编码的生物体14。在大肠杆菌中的工作去除了超过18,000个同义密码子，以产生一种仅使用61种密码子来编码常规氨基酸的具有压缩遗传密码的生物体。具有压缩遗传密码的重编码大肠杆菌为创建病毒抗性细胞和有义密码子重新分配奠定了基础，而有义密码子重新分配用于非常规氨基酸的掺入和所编码的非常规聚合物的合成15。合成其他基因组的尝试以及对基因组重编码、最小化或重新排列的策略正在进行中9,10,16-18。

2、大肠杆菌基因组合成基于rexer(复制子切除增强重组)5。在rexer中(图1a)，细菌人工染色体(bac)包含由目标合成dna以及其侧翼的双选择盒(由正选择标记和负选择标记组成)和基因组的50-152bp同源区组成的插入物，它被转化到含有编码crispr/cas9和lambda red重组机制的辅助质粒的细胞中。分离含有正确bac的单个克隆并使其变为感受态，然后将间隔子阵列(spacer array)引入感受态细胞，以激活cas9介导的含有合成dna的插入物从bac切除。将间隔序列设计为使得间隔rna与插入物同源区域中的独特序列碱基配对，并在插入物和bac骨架之间的连接处精确切割(图1b)。然后，通过lambda red重组机制，使用精确切除的插入物将合成dna插入基因组中以替换相应的基因组dna。基因组和合成dna中不同的双选择盒用于选择所需的整合(图1a)。从带有适当标记基因组的细胞到在rexer后琼脂平板上形成克隆集落需要四天的时间。

3、rexer的单个步骤已用于用合成的重编码dna替换高达136kb的基因组。从rexer的单个步骤产生的基因组为下一轮rexer提供模板，rexer(基因组交换逐步合成，genesis)的迭代使得大肠杆菌基因组的较大部分能够被合成dna替换。38个rexer步骤–每个步骤都需要设计、合成、克隆和验证定制间隔子配对–用于用合成的重编dna替换整个大肠杆菌基因组(跨七个菌株)。然后，通过接合将重编码dna汇编成单个菌株，以创建重编码生物体。

4、进一步简化和加速将合成dna引入大肠杆菌基因组的策略将是未来大规模基因组工程和基因组合成工作的关键。

技术实现思路

1、在本发明的一个方面，提供了一种将目标序列引入靶核酸中的方法，该方法包括

2、a)提供宿主细胞

3、所述宿主细胞包含附加型复制子(episomal replicon)，

4、所述附加型复制子包含骨架序列和供体核酸序列，

5、其中所述供体核酸序列依次包含：5'-同源重组序列1-目标序列-同源重组序列2-3'，

6、其中骨架序列包含位置邻近同源重组序列1的第一切除位点和位置邻近同源重组序列2的第二切除位点，

7、所述宿主细胞还包含靶核酸；

8、b)提供能够支持所述宿主细胞中核酸重组的辅助蛋白；

9、c)提供rna指导的dna核酸内切酶；

10、d)提供包含对第一切除位点特异的序列的第一rna分子和包含对第二切除位点特异的序列的第二rna分子，其中第一和第二rna分子有助于在切除过程中引导rna指导的dna内切核酸酶；

11、e)通过rna指导的dna核酸内切酶诱导所述供体核酸序列的切除；和

12、f)进行孵育以允许切除的供体核酸和所述靶核酸之间的重组。

13、rna指导的dna核酸内切酶可以是crispr-cas核酸酶，第一rna分子可以包含对第一切除位点特异的间隔子，并且第二rna分子可以包含对第二切除位点特异的间隔子。crispr-cas核酸酶可以是cas9。第一rna分子和/或第二rna分子可以由附加型复制子编码。

14、在一个实施方案中，切除的核酸的每个末端包含源自骨架序列的核酸序列。切除的供体核酸在每个末端可以包含源自骨架序列的核酸序列的6个或更少个碱基对。

15、在一个实施方案中，附加型复制子是细菌人工染色体。附加型复制子可以通过接合转移(conjugative transfer)递送至宿主细胞。

16、靶核酸可以是宿主细胞的基因组。宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌。

17、在本发明的一个方面，提供了一种组装核酸序列的方法，该方法包括：

18、(i)执行本发明的将目标序列引入靶核酸中的方法的步骤，以将第一供体核酸序列引入第一靶核酸中，从而产生第二靶核酸；和

19、(ii)执行本发明的将目标序列引入靶核酸中的方法的步骤，以将第二供体核酸序列引入第二靶核酸中，从而产生第三靶核酸。可以将部分(i)和部分(ii)进行迭代。

20、在一个实施方案中，针对部分(i)的第一rna分子的序列对于每次迭代都是相同的，和/或针对部分(i)的第二rna分子的序列对于每次迭代都是相同的；并且针对部分(ii)的第一rna分子的序列对于每次迭代都是相同的，和/或针对部分(ii)的第二rna分子的序列对于每次迭代都是相同的。

21、在一个实施方案中，所述方法还包括：

22、(iii)执行本发明的将目标序列引入靶核酸中的方法的步骤，以将第三供体核酸序列引入第三靶核酸中，从而产生第四靶核酸；

23、将部分(i)、(ii)和(iii)进行迭代，并且其中

24、针对部分(iii)的第一rna分子的序列对于每次迭代都是相同的，和/或针对部分(iii)的第二rna分子的序列对于每次迭代都是相同的。

25、在一个实施方案中，部分(i)包括使用包含第一骨架序列的编码供体核酸序列的附加型复制子，并且部分(ii)包括使用包含第二骨架序列的编码供体核酸序列的附加型复制子，其中

26、第一骨架序列包含第一标记或第一标记组，编码对所述第一骨架序列内的第一切除位点特异的第一rna分子，并编码对所述第一骨架序列内的第二切除位点特异的第二rna分子；和

27、第二骨架序列包含第二标记或第二标记组，编码对所述第二骨架序列内的第一切除位点特异的第一rna分子，并编码对所述第二骨架序列内的第二切除位点特异的第二rna分子；其中

28、第一标记或第一标记组不同于第二标记或第二标记组。

29、在本发明的另一方面，提供了一种构建附加型复制子的方法，包括以下步骤：

30、a)提供供体附加型复制子，所述复制子包含：

31、骨架，所述骨架包含通用间隔子序列，

32、特异于整合步骤n的第一同源区hrn，和第二通用同源区uhr，

33、位置邻近hrn的第一切除位点和位置邻近uhr的第二切除位点；

34、位置在hrn和uhr之间的供体核酸dnan；和

35、双选择盒，包含正选择标记和负选择标记；

36、b)提供包含组装性附加型复制子(assembly episomal replicon)的宿主细胞，所述组装性附加型复制子包含侧翼为hrn和uhr的包含正和负选择标记的双选择盒，组装性复制子中的双选择盒包含与供体复制子中的选择盒不同的标记；

37、c)提供能够支持所述宿主细胞中核酸重组的辅助蛋白；

38、d)提供rna指导的dna核酸内切酶；

39、e)提供包含对第一切除位点特异的序列的第一rna分子和包含对第二切除位点特异的序列的第二rna分子，其中第一和第二rna分子有助于在切除过程中引导rna指导的dna内切核酸酶；

40、f)在宿主细胞中诱导rna指导的dna核酸内切酶对所述供体核酸序列dnan的切除；和

41、g)进行孵育以允许切除的供体核酸和所述组装性复制子之间的重组，以形成包含核酸dnan的第二组装性复制子。

42、rna指导的dna核酸内切酶可以是crispr-cas核酸酶，第一rna分子可以包含对第一切除位点特异的间隔子，并且第二rna分子可以包含对第二切除位点特异的间隔子。crispr-cas核酸酶可以是cas9。第一rna分子和/或第二rna分子可以由附加型复制子编码。

43、在一个实施方案中，切除的核酸的每个末端包含源自骨架序列的核酸序列。切除的供体核酸在每个末端可以包含源自骨架序列的核酸序列的12、10、8、6、4或2个碱基对。优选地，切除的供体核酸在每个末端包含源自骨架序列的核酸序列的6个或更少个碱基对。

44、在一个实施方案中，附加型复制子是细菌人工染色体。附加型复制子可以通过接合转移递送至宿主细胞。

45、在本发明的优选方面，供体附加型复制子包含在供体宿主细胞中，并且细胞组装性复制子包含在受体宿主细胞中。供体和受体宿主细胞之间的接合可以有利地转移供体附加型复制子至受体宿主细胞。供体宿主细胞优选包含不可转移的f'质粒，使得f'-质粒不被转移至受体宿主细胞。优选地，f'质粒不可通过orit删除而转移。供体附加体是可转移的，并且可包含orit。

46、宿主细胞的选择可以如所描述的那样完成，但是使用重组供体和组装性复制子dna中存在的正选择标记和负选择标记。

47、靶核酸可以是宿主细胞的基因组。宿主细胞可以是原核细胞，例如大肠杆菌。

48、在一个实施方案中，供体核酸包含同源区hrn+1，并且所述方法进一步包括步骤(h)将包含供体核酸dnan+1的另一供体附加型复制子引入宿主细胞中，和在宿主细胞中诱导rna指导的dna核酸内切酶对所述供体核酸序列dnan+1的切除；以及进行孵育，以允许切除的供体核酸dnan+1与所述第二组装性复制子之间的重组而形成包含核酸dnan和核酸dnan+1的第三组装性复制子。

49、所述方法步骤可以迭代地重复(iteratively repeated)。

50、本发明的这个方面提供的复制子可以用于前述方面描述的组装核酸序列的方法。

51、在本发明所有方面的有利实施方案中，宿主细胞缺乏功能性(competent)reca和/或reco。优选地，宿主细胞缺乏reca(δreca)。