一种大肠杆菌基因组编辑gRNA质粒及其构建方法与流程

本发明属生物，具体涉及一种大肠杆菌基因组编辑grna质粒及其构建方法。

背景技术：

1、大肠杆菌基因组编辑是现代分子生物学研究中的基础技术之一。通过定向编辑细菌基因组中的特定位点，研究人员可以揭示相关基因的功能和调控机制。近年来，crispr-cas9基因编辑技术已经成为该领域的新高峰，带来了更高度的可编程性和精度。在基于cas9的基因编辑技术中，grna起到了关键作用，因为它是将cas9引导到特定基因组位点的关键元件。

2、通过设计不同的grna序列，研究人员可以选择性地编辑目标基因中的特定区域，包括敲除、插入或替换相应的dna片段。此外，科学家们可以设计多个grna来同时编辑多个基因，从而突显这些基因之间的相互作用和调控机制。尽管crispr-cas9技术在细菌基因组编辑中表现出了高度可编程性和精确性，但它仍面临一些挑战和限制。例如，一些靶向dna区域的难度较大，需要更高度优化的grna设计和实验验证。

3、n20序列是grna中用于识别靶向dna区域的关键序列。然而，不同的n20序列可能具有不同的特异性和效率，导致靶向效应的差异。因此，需要定量评估不同的n20序列并优化grna的设计，以提高编辑效率和精确性。

4、大肠杆菌对某些抗生素具有天然的耐药性。这是因为大肠杆菌染色体中含有一种名为flor的耐药基因，能够使大肠杆菌对抗生素产生耐药性，可能会影响grna的靶向效果，也可能会出现糊板现象，从而导致基因组编辑的失败。

5、由于grna和donor dna的引入都会对细胞产生影响，grna和donor dna会形成复合物，从而降低编辑效率。

6、为了克服上述问题，需要对质粒的设计和转化条件进行优化，以提高grna质粒在大肠杆菌中的使用效率和可靠性。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种大肠杆菌基因组编辑改良的grna质粒及其构建方法和优化工艺。该技术首先通过grna质粒g为出发载体，将壮观霉素抗性替换为氨苄抗性，并在骨架处通过一步pcr引入双拷贝的n20序列，获得载体a。基于该载体和cas9质粒进行大肠杆菌基因编辑工艺改良，包括如下要点：cas9质粒化学转化至大肠杆菌，制成感受态；a与donor间隔加入感受态，从而避免两者之间的相互干扰影响编辑效率；感受态加入双抗性恢复培养基孵育；孵育时长延长至1.5小时。该技术在编辑bl21(de3)的cada基因时，转化子数目每微克dna数以百计，达到了100％的敲除率，未发生糊板，相较于文献报道的13/15，转化子多出了一个数量级，敲除率提高了13％。从而有望基于cas9编辑技术在短时间进行大量的建库筛选，为开展基础研究和应用研究提供更好的技术支持。

2、本发明第一方面的目的，在于提供一种grna质粒。

3、本发明第二方面的目的，在于提供一种基因编辑质粒。

4、本发明第三方面的目的，在于提供一种试剂盒。

5、本发明第四方面的目的，在于提供一种宿主细胞。

6、本发明第五方面的目的，在于提供本发明第一方面的grna质粒、本发明第二方面的基因编辑质粒、本发明第三方面的试剂盒或本发明第四方面的宿主细胞在大肠杆菌基因组编辑中的应用。

7、本发明第六方面的目的，在于提供一种大肠杆菌cada基因的敲除方法。

8、为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

9、本发明的第一个方面，提供一种grna质粒，包括载体质粒、氨苄抗性基因和n20序列，所述氨苄抗性基因和n20序列构建至载体质粒，所述氨苄抗性基因替换载体质粒中的壮观霉素抗性基因。

10、在本发明一些实施方式中，所述载体质粒包括pecgrna、pgrna中任意一种。

11、在本发明一些实施方式中，所述载体质粒为pecgrna。

12、在本发明一些实施方式中，所述grna质粒为靶向cada的grna质粒。

13、在本发明一些实施方式中，所述n20序列如seq id no:7所示。

14、在本发明一些实施方式中，所述氨苄抗性基因的序列如seq id no:20所示。

15、在本发明一些实施方式中，所述grna质粒的制备方法包括以下步骤：

16、(1)以质粒pecgrna为模板，使用seq id no:3和seq id no:4所示的引物进行扩增，得到去除壮观霉素抗性基因的g骨架；

17、(2)使用即用型无缝克隆试剂盒将氨苄抗性基因(amp)与去除壮观霉素抗性基因的g骨架同源重组，得到重组质粒；

18、(3)将重组质粒转化至db3.1感受态，培养，得到载体g-amp；

19、(4)以载体g-amp为模板，采用一步pcr引入双拷贝n20，得到重组质粒转化至dh5α，培养提取质粒即得到grna质粒a。

20、在本发明一些实施方式中，步骤(4)具体为：以载体g-amp为模板，使用seq id no:5和seq id no:6所示引物对进行扩增，使其在pcr反应中成环，转入dh5α感受态细胞进行细胞内扩增，即得到grna质粒。

21、在本发明一些实施方式中，所述扩增氨苄抗性基因的引物序列如seq id no:1和seq id no:2所示。

22、本发明的第二个方面，提供一种基因编辑质粒，包括本发明第一方面的grna质粒和cas9的编辑基因。

23、本发明的第三个方面，提供一种试剂盒，包括本发明第二方面的基因编辑质粒和维持所述基因编辑质粒转化活性的试剂。

24、本发明的第四个方面，提供一种宿主细胞，所述宿主细胞携带有本发明第二方面的基因编辑质粒。

25、本发明的第四个方面，提供本发明第一方面的grna质粒、本发明第二方面的基因编辑质粒、本发明第三方面的试剂盒或本发明第四方面的宿主细胞在大肠杆菌基因组编辑中的应用。

26、在本发明一些实施方式中，所述基因编辑包括基因编辑敲除、外源基因编辑插入、基因编辑替换和基因重组中至少一种。

27、本发明的第五个方面，提供一种大肠杆菌cada基因的敲除方法，包括使用本发明第一方面的grna质粒、本发明第二方面的基因编辑质粒、本发明第三方面的试剂盒或本发明第四方面的宿主细胞处理大肠杆菌的步骤。

28、在本发明一些实施方式中，所述敲除方法包括以下步骤：

29、(1)将cas9质粒转化至大肠杆菌，制成含cas9质粒的大肠杆菌感受态；

30、(2)将本发明第一方面的grna质粒与步骤(1)中含cas9质粒的大肠杆菌感受态混合，静置5～25分钟后，与donor dna混合；

31、(3)电转步骤(2)混合后的感受态细胞，加入含氨苄和卡那霉素的培养基中，培养，即可完成对大肠杆菌cada基因的敲除。

32、在本发明一些实施方式中，(3)中所述电转的条件为2～3kv，4～6ms。

33、在本发明一些优选实施方式中，(3)中所述电转的条件为2～2.5kv，4～5ms。

34、在本发明一些实施方式中，(2)中静置时间为10～15分钟。

35、在本发明一些实施方式中，(2)中所述grna质粒和donor dna的质量比为1:3～5。

36、在本发明一些优选实施方式中，(2)中所述grna质粒和donor dna的质量比为1:3～4。

37、在本发明一些更优选实施方式中，(2)中所述grna质粒和donor dna的摩尔质量比为1:4。

38、在本发明一些实施方式中，步骤(2)在冰上进行。

39、在本发明一些实施方式中，(3)中培养基中含有80～120μg/ml氨苄和40～60μg/ml卡那霉素。

40、在本发明一些优选实施方式中，所述培养基中含有100μg/ml氨苄和50μg/ml卡那霉素。

41、在本发明一些实施方式中，所述培养基为lb培养基。

42、在本发明一些实施方式中，所述培养条件为200～220rpm，35～37℃培养1～3小时。

43、在本发明一些优选实施方式中，所述培养条件为220rpm，37℃培养1.5小时。

44、在本发明一些实施方式中，所述donor dna的制备方法如下：

45、以大肠杆菌bl21(de3)为模板，使用seq id no:10和seq id no:11以及seq idno:12和seq id no:13所示的引物对分别扩增cada基因的上下游500bp左右序列；使用seqid no:16和seq id no:17所示的引物对将上述两段序列进行融合扩增，即得到donor dna。

46、在本发明一些实施方式中，所述cas9质粒为peccas9(金斯瑞公司)或pcas9(addgene公司)。

47、本发明的有益效果是：

48、本发明提供的grna质粒中将壮观霉素抗性替换为氨苄抗性，可有效解决转化子的糊板问题。且通过在载体质粒上引入双拷贝的n20序列，双拷贝grna可以同时对靶位点进行同向性切割，从而加强了编辑的效果，并且降低了在其他位置引起假阳性的可能性。

49、本发明提供的大肠杆菌基因编辑工艺中，将cas9质粒转至大肠杆菌，制成感受态，无需使用电转，节约了时间及成本；grna质粒与donor间隔加入感受态，从而避免两者之间的相互干扰影响编辑效率；感受态加入双抗性恢复培养基孵育，孵育时长延长至1.5小时，通过施加抗性压力和适宜的反应时间保证基因编辑的效果，且能控制基因组被过分剪切而导致菌死亡。在编辑bl21(de3)的cada基因时，转化子数目每微克dna数以百计，达到了100％的敲除率，未发生糊板，相较于文献报道的13/15，转化子多出了一个数量级，敲除率提高了13％。