一种H3N2亚型流感病毒抗原逃逸株及其筛选方法和应用

本发明属于疾病防治，具体涉及一种h3n2亚型流感病毒抗原逃逸株及其筛选方法和应用。

背景技术：

1、猪流感(swine influenza，si)是由猪流感病毒(swine influenzavirus，siv)引起的一种猪的急性、热性、高度接触性呼吸道传染病，其特征为发热、流鼻涕、精神沉郁、呼吸困难等。一年四季均可流行，发病率高、死亡率低。猪作为流感病毒的“混合器”，在病毒种间传播和新型流感病毒的产生过程中扮演着重要的角色。目前我国广泛流行的siv亚型主要有h1n1、h1n2和h3n2。

2、siv频繁地发生抗原性变异使得疫病难以防控，抗原变异有两种形式：抗原漂移和抗原转变。ha和na糖蛋白最易发生抗原漂移，部分抗原漂移可导致病毒逃避中和抗体的识别引发流感病毒中小规模流行。其中ha蛋白决定了病毒的抗原性、受体结合特异性、致病性、毒力等生物学特性。h3亚型sivha蛋白的抗原区分别为a、b、c、d、e，5个抗原区，其中131个氨基酸位点是特异性抗体的主要靶点,第145、155、156、158、159、189和193位氨基酸在病毒的抗原性中起重要作用。其中a和b抗原区的变异较为频繁，a抗原区中133、144～145位，b抗原区中155、156、159、193和197位氨基酸变异最为活跃。c、d、e抗原区中275～278、172～174和78～83位点抗原性一般。有研究表明，抗原表位氨基酸的变化影响抗原逃逸株的中和作用。但抗原性与抗原表位的关联性并不是一成不变，有些抗原位点以外的氨基酸变异也可能在一定程度上影响病毒的抗原性。

3、抗原表位又称为抗原决定簇，通过特定抗体鉴定抗原表位的传统方法主要有：x-衍射结晶学和核磁共振技术、肽扫描技术、氨基酸定点突变技术、噬菌体展示技术、免疫亲和质谱技术等。传统鉴定技术具有一定的局限性，但是将传统技术与新型生物技术相结合可以克服这种局限性，新型鉴定方法具有快速、精确、高通量、低成本等优点。现阶段的新型鉴定方法主要有：噬菌体肽库技术结合多肽芯片技术、细菌表面展示技术结合流式细胞技术，氨基酸定点突变技术结合免疫亲和质谱技术等。自然界中通常可以分离到流感病毒的抗原变异株，但在实验室内使用抗体也可以筛选到相应的抗原变异株，从而鉴定和分析抗原位点。

4、综上所述，多种亚型、不同基因型的流感病毒株在猪群中共流行的态势表明siv对公共卫生的潜在威胁时刻存在。因此，全球范围内siv系统监测必须进一步加强，尤其是对新变异株的出现做好预警预报，对于全球流感大流行的应对是至关重要的。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种h3n2亚型流感病毒抗原逃逸株及其筛选方法和应用，为h3n2亚型siv抗原变异趋势及方向提供预测指导，提高对流感的防控水平。

2、本发明提供了利用抗h3n2亚型siv a/swine/guangdong/9/2005(简称gd9/05)ha蛋白单克隆抗体2f10和h3n2亚型siva/swine/guangdong/9/2005在mdck细胞中进行连续传代培养筛选得到的抗所述单克隆抗体2f10的抗原逃逸毒株。

3、本发明还提供了上述抗原逃逸毒株的筛选方法，包括以下步骤：将h3n2亚型siva/swine/guangdong/9/2005与上述单克隆抗体2f10在mdck细胞中进行连续传代培养，并在培养时逐代次加大所述单克隆抗体的浓度，对每代病毒进行ha基因测序，筛选得到所述抗原逃逸毒株。

4、本发明还提供了一株利用上述筛选方法筛选得到的抗h3n2亚型siv a/swine/guangdong/9/2005ha蛋白单克隆抗体的h3n2亚型流感病毒抗原逃逸株gd9-2f10-p14，所述h3n2亚型流感病毒抗原逃逸株gd9-2f10-p14的保藏编号为cctccno:v202402。

5、优选的，所述h3n2亚型流感病毒抗原逃逸株gd9-2f10-p14相比于h3n2亚型siva/swine/guangdong/9/2005株，ha蛋白存在p21s和k397e突变，np蛋白存在d51n突变。

6、本发明还提供了一种包含上述抗原逃逸毒株或上述h3n2亚型流感病毒抗原逃逸株gd9-2f10-p14的基因组的生物材料。

7、本发明还提供了一种包含上述抗原逃逸毒株或上述h3n2亚型流感病毒抗原逃逸株gd9-2f10-p14在制备预防猪流感的疫苗中的用途。

8、有益效果：本发明提供了利用具有较好中和活性的gd9/05ha蛋白单克隆抗体2f10，将gd9/05与所述mab在mdck细胞中连续传代共培养，筛选到gd9/05病毒逃逸株中和性mabs2f10的抗原突变株gd9-2f10-p14，其相应的逃逸位点为p21s/k397e。

9、在本发明实施例中，经研究发现gd9/05病毒ha蛋白p21s和k397e突变能够导致病毒抗原性发生变化；ha蛋白p21s/k397e双点突变及np蛋白d51n突变对病毒在细胞中的复制特性具有一定影响：本发明提供的所述抗原逃逸株与亲本病毒血清的反应性差异不显著，而单点突变病毒rgd9/p21s和rgd9/k397e与亲本病毒血清的反应性均降低4倍以上，表明p21s和k397e突变能够导致病毒抗原性发生变化；本发明提供的所述抗原逃逸株在a549细胞中的复制滴度较gd9/05亲本毒株显著增高；同时逃逸株在mdck细胞中形成蚀斑的大小和数量也均受到一定的影响。本发明提供的抗原逃逸株能够确定h3n2亚型siv ha蛋白极易发生突变的氨基酸位点，并分析氨基酸突变对病毒生物学活性的影响，为揭示h3n2亚型siv逃逸抗体中和的分子机制奠定基础。

10、生物保藏信息

11、h3n2亚型流感病毒抗原逃逸株gd9-2f10-p14，于2024年1月10日保藏到中国典型培养物保藏中心(简称cctcc)，保藏地址为中国武汉武汉大学，保藏编号为cctcc no：v202402。

技术特征：

1.利用抗h3n2亚型siv a/swine/guangdong/9/2005ha蛋白单克隆抗体2f10和h3n2亚型siva/swine/guangdong/9/2005在mdck细胞中进行连续传代培养筛选得到的抗所述单克隆抗体2f10的抗原逃逸毒株。

2.权利要求1所述抗原逃逸毒株的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：将h3n2亚型siva/swine/guangdong/9/2005与所述单克隆抗体2f10在mdck细胞中进行连续传代培养，并在培养时逐代次加大所述单克隆抗体的浓度，对每代病毒进行ha基因测序，筛选得到所述抗原逃逸毒株。

3.一株利用权利要求2所述筛选方法筛选得到的抗h3n2亚型siv a/swine/guangdong/9/2005ha蛋白单克隆抗体的h3n2亚型流感病毒抗原逃逸株gd9-2f10-p14，所述h3n2亚型流感病毒抗原逃逸株gd9-2f10-p14的保藏编号为cctccno:v202402。

4.根据权利要求3所述h3n2亚型流感病毒抗原逃逸株gd9-2f10-p14，其特征在于，所述h3n2亚型流感病毒抗原逃逸株gd9-2f10-p14相比于h3n2亚型siva/swine/guangdong/9/2005株，ha蛋白存在p21s和k397e突变，np蛋白存在d51n突变。

5.一种包含权利要求1所述抗原逃逸毒株或权利要求3或4所述h3n2亚型流感病毒抗原逃逸株gd9-2f10-p14的基因组的生物材料。

6.权利要求1所述抗原逃逸毒株或权利要求3或4所述h3n2亚型流感病毒抗原逃逸株gd9-2f10-p14或权利要求5所述生物材料在制备预防猪流感的疫苗中的用途。

技术总结本发明公开了一种H3N2亚型流感病毒抗原逃逸株及其筛选方法和应用，属于疾病防治技术领域。本发明将A/swine/Guangdong/9/2005(简称GD9/05)与HA蛋白单克隆抗体2F10在MDCK细胞中连续传代共培养，筛选到GD9/05病毒逃逸中和性mAbs 2F10的抗原突变株GD9‑2F10‑P14，其HA蛋白相应的逃逸位点为P21S/K397E。本发明提供的所述抗原逃逸株在A549细胞中的复制滴度较亲本毒株显著增高，同时逃逸株在MDCK细胞中形成蚀斑的大小和数量也均受到一定的影响。技术研发人员：乔传玲,陈化兰,陈艳,杨焕良,王秀荣受保护的技术使用者：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心哈尔滨分中心）技术研发日：技术公布日：2024/6/18