一种同时检测副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌的引物组、试剂盒和方法

本发明属于分子生物学检测领域，具体涉及一种同时检测副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌的引物组、试剂盒和方法。

背景技术：

1、水产品由于其味道鲜美、营养丰富且具有独特的活性成分，越来越受到人们的青睐。食源性致病菌等生物性污染是影响水产品质量安全的重要因素，针对水产品中主要食源性致病菌检测时效低、依赖专业实验室等问题，以水产品中主要食源性致病菌(副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌)为检测对象，建立可同时检测副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌的三重raa-lfd快速可视化检测试剂盒，适用于低资源环境下对水产品中副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌的快速筛查和早期诊断，为更好地防控水产品引起的细菌性疾病提供技术支撑，对保障我国水产品质量安全具有重要意义。

2、传统的细菌检测方法包括生理生化法，这种方法在检测相似表型时会出现漏检与假阴性等结果，并且耗费的时间较长。分子检测技术是近些年发展的新技术，如：聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，pcr)、环介导等温核酸扩增技术(loop-mediatedisothermal amplification，lamp)等，pcr检测食源性致病菌被称为“金标准”，但其依赖昂贵的热循环仪器、对操作人员有较高的技术要求；lamp法比pcr法需要较少的检测时间，但其需要4～6对引物，较为复杂，均不能满足现场快速检测的需求。

3、重组酶介导等温扩增技术(recombinase aided amplification，raa)可以在较低温度(35～40℃)与较短时间内依赖重组酶、单链dna结合蛋白和聚合酶的参与完成解链、配对、延伸等过程，目前重组酶等温扩增技术结合侧流层析试纸条(raa-lfd)已广泛用于寄生虫、病毒、病原菌的现场诊断，然而现有技术中没有同时检测副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌的raa-lfd方法的相关报道。

技术实现思路

1、为克服现有技术的上述缺陷，本发明的主要目的是提供一种同时检测副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌的引物组。

2、本发明的另一目的是提供一种同时检测副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌的试剂盒，其包含上述引物组。

3、本发明的再一目的是提供一种同时检测副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌的方法，通过raa-lfd技术同时检测副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌，可在非实验室环境中快速、灵敏以及高特异性的检测副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌，在低资源环境和检测现场快速实现核酸体外扩增，摆脱仪器束缚，且降低成本。

4、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

5、本发明的第一方面，提供一种基于raa-lfd技术同时检测副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌的三重特异性引物组合，包括三组引物；

6、第一组引物用于特异性扩增副溶血性弧菌，上游引物序列如seq id no:1所示，下游引物序列如seq id no:2所示；

7、第二组引物用于特异性扩增单增李斯特菌，上游引物序列如seq id no:3所示，下游引物序列如seq id no:4所示；

8、第三组引物用于特异性扩增沙门氏菌，上游引物序列如seq id no:5所示，下游引物序列如seq id no:6所示；具体序列如下：

9、seq id no:1：tctgatgacaatgacgcctctgctaatgag；

10、seq id no:2：gtagtaatagtgccaaaaataaaataacgc；

11、seq id no:3：cgtaagtgggaaatctctctcaggtgatgtag；

12、seq id no:4：tcttttaagaagtttgttgtataggcaatggg；

13、seq id no:5：cgtggtccagtttatcgttattaccaaagg；

14、seq id no:6：ggtataagtagacagtgcggaggactaatcca。

15、进一步，所述第一组引物的上游引物5’端修饰生物素类化合物，下游引物5’端修饰标记物1；所述第二组引物的上游引物5’端修饰生物素类化合物，下游引物5’端修饰标记物2；所述第三组引物的上游引物5’端修饰生物素类化合物，下游引物5’端修饰标记物3；其中所述标记物1、2和3选自地高辛(digoxigenin)或荧光素类化合物。

16、更进一步，所述生物素类化合物为生物素(biotin)，所述标记物1采用6-羧基四甲基罗丹明(tamra)，所述标记物2采用6-羧基荧光素(6-fam)或异硫氰酸荧光素(fitc)，所述标记物3采用地高辛。

17、本发明的第二方面，提供所述三重特异性引物组合用于制备同时检测副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌的试剂盒，或者用于非诊断目的同时检测副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌。

18、本发明的第三方面，提供一种基于三重raa-lfd技术同时检测副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌的试剂盒，含有所述三重特异性引物组合。

19、进一步，所述试剂盒还含有raa核酸扩增试剂盒和侧流层析试纸条。

20、更进一步，所述raa核酸扩增试剂盒包括冻干粉、基础缓冲溶液、醋酸镁、纯化水、阴性质控品和阳性质控品。

21、更进一步，所述侧流层析试纸条上设有t1检测线、t2检测线和t3检测线，分别用于捕获标记物1、标记物2和标记物3。

22、本发明的第四方面，提供一种同时检测副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌的raa-lfd方法，包括如下步骤：

23、(1)将所述特异性引物组合与待测样品混合，配制raa反应体系，并在33～41℃下扩增反应10～30min；

24、(2)取5μl扩增产物加入95μl ddh2o中(产物稀释20倍)，混合均匀，取80μl滴加到侧流层析试纸条上，5～10min后读取结果。

25、进一步，步骤(1)中，所述待测样品经过提取总dna，反应时间为20～30min。

26、进一步，所述侧流层析试纸条上设有t1检测线、t2检测线、t3检测线和质控线，分别标记有抗标记物1的抗体、抗标记物2的抗体、抗标记物3的抗体和二抗。

27、更进一步，所述侧流层析试纸条的t1检测线上标记有抗荧光素6-羧基四甲基罗丹明的抗体，t2检测线上标记有抗荧光素6-羧基荧光素的抗体，t3检测线上标记有抗地高辛的抗体，质控线上标记有二抗。

28、更进一步，步骤(1)中，所述待测样品经过富集并提取总dna，反应时间为20min。

29、进一步，步骤(2)中，结果的判断如下：

30、(1)当t1检测线、t2检测线、t3检测线和质控线均出现条带时，说明待测样品中同时含有副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌；

31、(2)当只有t1检测线和质控线出现条带时，说明待测样品中含有单增李斯特菌，不含副溶血性弧菌和沙门氏菌；

32、(3)当只有t2检测线和质控线出现条带时，说明待测样品中含有副溶血性弧菌，不含单增李斯特菌和沙门氏菌；

33、(4)当只有t3检测线和质控线出现条带时，说明待测样品中含有沙门氏菌，不含副溶血性弧菌和单增李斯特菌；

34、(5)当t1检测线、t2检测线和质控线均出现条带时，说明待测样品中同时含有单增李斯特菌和副溶血性弧菌，不含沙门氏菌；

35、(6)当t1检测线、t3检测线和质控线出现条带时，说明待测样品中含有单增李斯特菌和沙门氏菌，不含副溶血性弧菌；

36、(7)当t2检测线、t3检测线和质控线出现条带时，说明待测样品中含有副溶血性弧菌和沙门氏菌，不含单增李斯特菌；

37、(8)当只有质控线出现条带，检测线没有条带时，说明结果为阴性，即待测样品中不含副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌，或副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌的含量低于三重raa-lfd法的检出限；

38、(9)当检测线和质控线均没有出现条带，说明检测结果无效。

39、本发明首先根据副溶血性弧菌特异性基因(toxr基因)、单增李斯特菌特异性基因(hlya基因)和沙门氏菌特异性基因(inva基因)分别设计特异性引物，结果发现，由于引物二聚体的影响，基于上述特异性引物进行三重raa-lfd技术检测出现假阳性的结果。因此，对所获得的引物进行碱基替换，以避免产生二聚体，并且获得特异性强、灵敏度高的引物，能从其他致病菌中准确的检测出副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌。

40、与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

41、1.本发明中基于三重raa-lfd技术的三重特异性引物，经过序列改良后，不会出现因产生引物二聚体而出现假阳性结果现象，特异性强，灵敏度高。

42、2.本发明中基于三重raa-lfd技术的试剂盒，可同时检测副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌，操作简便。

43、3.本发明中基于三重raa-lfd技术同时检测副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌，表现出良好的特异性，能在其他致病菌中准确检测出副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌。

44、4.本发明的引物组合及检测方法对副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌基因组dna的检出限均达到103fg/μl，对副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌纯菌液的检出限分别达到102cfu/ml、107cfu/ml和105cfu/ml；当经过富集6h后，可以检测到低至100cfu的副溶血性弧菌和102cfu沙门氏菌，灵敏度高。

45、5.本发明中基于三重raa-lfd技术同时检测副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌的方法对仪器设备要求低，在较低的反应温度如37℃下孵育20min便能完成扩增，再用试纸条检测5min即可完成检测。同时，其扩增产物通过lfd检测后，结果肉眼可得，结果判定简单，适用于在野外等资源有限的环境中快速检测副溶血性弧菌、单增李斯特菌和沙门氏菌，具有良好的应用前景。