单价抗备解素抗体及抗体片段的制作方法

背景技术：

1、补体系统在清除免疫复合物和对感染因子、外来抗原、病毒感染细胞和肿瘤细胞的免疫应答中起重要作用。补体激活主要通过三种途径发生：经典途径(classicalpathway)、凝集素途径(lectin pathway)和替代途径(alternative pathway)。不受控制的激活或对替代补体途径的不充分调节可导致全身性炎症、细胞损伤和组织损伤。替代补体途径涉及越来越多的多种疾病的发病机理。备解素(properdin)通过结合和稳定c3和c5转化酶复合物(c3bbb和c3bnbb)积极调节替代补体途径激活。对备解素活性的抑制或调节是减轻症状和减缓与替代补体途径失调相关的疾病进展的重要治疗策略。对于有效调节备解素活性仍存在未满足的需求。

技术实现思路

1、本文描述了分离的单价抗体及其抗体片段，其特异性或基本上特异性结合备解素并选择性地阻断替代补体途径激活。通过抑制备解素的功能活性，本文所述的单价抗体抑制膜攻击复合物的替代补体途径诱导的组装。此外，单个备解素分子与单价抗体的选择性结合可以减少由聚集引起的不期望的免疫复合物。因此，单个备解素单体或多聚体的选择性靶向可以反过来改善由替代补体途径失调介导的疾病患者的临床益处。

2、在一个实施方案中，本技术实现要素：涉及分离的单价抗体或其抗体片段，其中抗体或其抗体片段结合人备解素。在一个具体实施方案中，抗体或片段是骆驼科动物抗体。在特定实施方案中，抗体或片段是单结构域抗体(single-domain antibody)。在一个具体实施方案中，抗体或片段结合人备解素的tsr0和/或tsr1。在一个具体实施方案中，抗体或片段结合氨基酸序列lcqpcrsprwslwstwapcsvtcsegsqlryrrcvgwngq(seq id no:8)内的表位。在一个具体实施方案中，抗体或片段以小于50nm的亲和力结合小鼠备解素。在一个具体实施方案中，所述抗体或片段包含选自以下的至少一个或所有三个cdr：a)包含氨基酸序列grifevnmma(seq id no:9)的cdr-h1；b)包含氨基酸序列rvgttx1yadsvkg(seq id no:10)的cdr-h2，其中x1是极性或非极性氨基酸；和c)包含氨基酸序列lqyx2ryggaey(seq id no:11)的cdr-h3，其中x2极性氨基酸。在一个具体实施方案中，cdr-h2包括氨基酸序列rvgttvyadsvkg(seq id no:12)。在一个具体实施方案中，cdr-h3包括氨基酸序列lqydryggaey(seq id no:12)。在一个具体实施方案中，cdr-h2包括氨基酸序列rvgtttyadsvkg(seq id no:15)。在一个具体实施方案中，cdr-h3具有氨基酸序列lqysryggaey(seq id no:14)。在一个具体实施方案中，cdr-h3具有氨基酸序列lqydryggaey(seq id no:13)。在一个具体实施方案中，cdr-h3具有氨基酸序列lqydryggaey(seq id no:13)。在一个具体实施方案中，cdr-h3具有氨基酸序列lqysryggaey(seq id no:14)。在一个具体实施方案中，所述抗体或片段包括具有以下序列的3个cdr：a)具有氨基酸序列grissiihma(seq id no:16)的cdr-h1；b)具有氨基酸序列rvgttvyadsvkg(seq id no:12)的cdr-h2；和c)具有氨基酸序列lqyekhggady(seq id no:17)的cdr-h3。在一个具体实施方案中，所述抗体包括具有以下序列的6个cdr：a)具有氨基酸序列gyiftnypih(seq id no:18)的cdr-h1；b)具有氨基酸序列fidpgggydepderfrd(seqid no:19)的cdr-h2；c)具有氨基酸序列rgggyyldy(seq id no:20)的cdr-h3；d)具有氨基酸序列rasqdisffln(seq id no:21)的cdr-l1；e)具有氨基酸序列ytsryhs(seq id no:22)的cdr-l2；和f)具有氨基酸序列qhgntlpwt(seq id no:23)的cdr-l3。在一个具体实施方案中，所述抗体包括具有以下序列的6个cdr：a)具有氨基酸序列gfslttygvh(seq id no:24)的cdr-h1；b)具有氨基酸序列viwsggdtdynasfis(seq id no:25)的cdr-h2；c)具有氨基酸序列nkdyytnydftmdy(seq id no:26)的cdr-h3；d)具有氨基酸序列kssqsvlyssnqknfla(seq id no:27)的cdr-l1；e)具有氨基酸序列wastres(seq id no:28)的cdr-l2；和f)具有氨基酸序列hqylssyt(seq id no:29)的cdr-l3。在一个具体实施方案中，所述抗体包括具有以下序列的6个cdr：a)具有氨基酸序列gytfidywie(seq id no:30)的cdr-h1；b)具有氨基酸序列eifpgsgtinhnekfkd(seq id no:31)的cdr-h2；c)具有氨基酸序列egldy(seq idno:32)的cdr-h3；d)具有氨基酸序列sasssvsyiy(seq id no:33)的cdr-l1；e)具有氨基酸序列dtstlas(seq id no:34)的cdr-l2；和f)具有氨基酸序列qqwsrnpft(seq id no:35)的cdr-l3。在一个具体实施方案中，所述抗体包括具有以下序列的6个cdr：a)具有氨基酸序列gfsltsygvh(seq id no:36)的cdr-h1；b)具有氨基酸序列viwsggstdynaafis(seq id no:37)的cdr-h2；c)具有氨基酸序列nkdfysnydytmdy(seq id no:38)的cdr-h3；d)具有氨基酸序列kssqsvlyssnqknfla(seq id no:27)的cdr-l1；e)具有氨基酸序列wastres(seq idno:28)的cdr-l2；和f)具有氨基酸序列hqylssyt(seq id no:29)的cdr-l3。在一个具体实施方案中，所述抗体包括具有以下序列的6个cdr：a)具有氨基酸序列gytxtaygin(seq idno:39)的cdr-h1；b)具有氨基酸序列yiyigngytdynekfkg(seq id no:40)的cdr-h2；c)具有氨基酸序列sgwdedyamdf(seq id no:41)的cdr-h3；d)具有氨基酸序列raseniysyla(seqid no:42)的cdr-l1；e)具有氨基酸序列haktlae(seq id no:43)的cdr-l2；和f)具有氨基酸序列qhhygpppt(seq id no:44)的cdr-l3。在一个具体实施方案中，抗体或片段抑制人备解素的活性。

3、在一个实施方案中，本公开内容涉及结合人备解素的分离的单价抗体或其抗体片段在治疗由替代补体途径失调介导的疾病的方法中，或在制备用于治疗由替代补体途径失调介导的疾病的药物中的用途。

4、在一个实施方案中，本公开内容涉及治疗由替代补体途径失调介导的疾病的方法。该方法包括给予有效量的分离的单价抗体或其抗体片段的抗体，其中抗体或抗体片段将人备解素结合至有此需要的患者。在一个具体实施方案中，所述疾病是自身免疫性血栓性血小板减少性紫癜(ttp)、溶血性尿毒症综合征(hus)、非典型溶血性尿毒症综合征(ahus)、阵发性睡眠性血红蛋白尿症(pnh)、iga肾病(贝格尔病)、哮喘、c3肾小球病(c3g)、戈谢病、化脓性汗腺炎、白塞病、严重烧伤、早期败血症、皮肌炎、肺炎球菌性脑膜炎、阿尔茨海默病、癌症转移、急性呼吸窘迫综合征(ards)、急性肺损伤(aci)、输血相关性肺损伤(trali)、血液透析诱导血栓形成、大疱性表皮松解症(eba)、葡萄膜炎、帕金森病、原发性胆道闭锁、抗中性粒细胞胞浆抗体(anca)血管炎、视网膜变性、广泛血栓性微血管病变(tma)、广泛tma(aps)、造血干细胞疗法(hsct)tma、年龄相关性黄斑变性(amd)、先兆子痫、溶血、肝酶升高、低血小板(hellp)综合征、多发性硬化症、抗磷脂综合征(aps)、复发性多软骨炎、缺血性损伤、中风、移植物抗宿主病(gvhd)、慢性阻塞性肺病(copd)、肺气肿、动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征、失血性休克、类风湿性关节炎、透析(心血管风险)、心血管疾病、胎盘疟疾、抗磷脂综合征(aps)妊娠丢失、膜增生性(mp)肾小球肾炎、膜性肾炎、脑炎、脑损伤、n-甲基-d-天冬氨酸(nmda)受体抗体脑炎、疟疾溶血危象、腹主动脉瘤(aaa)或胸腹主动脉瘤(taa)。

5、在一个实施方案中，本公开内容涉及抑制替代补体途径膜攻击复合物组装的方法。该方法包括向有此需要的患者施用有效量的抗体，抗体衍生物或其片段。在一个具体实施方案中，该方法抑制替代补体途径依赖性溶血。

6、在一些实施方案中，抗体或其片段包括以下序列：evqlvesggglvkpggslrlscaasgrpvsnyaaawfrqapgkerefvsainwqktatyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycaavfrvvapktqydydywgqgtlvtvssggggsggggsggggslevqlvesggglvqaggslrlscaasgrissiihmawyrqapgkqrelvaeisrvgttvyadsvkgrftisrddakntvtlqmnslkpedtavyycnalqyekhggadywgqgtqvtvss(seq id no:45)。

7、在一些实施方案中，抗体或其片段包括以下序列：evqlvesggglvkpggslrlscaasgrpvsnyaaawfrqapgkerefvsainwqktatyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycaavfrvvapktqydydywgqgtlvtvssggggsggggsggggsevqllesggglvqpggslrlscaasgrissiihmawfrqapgkerelvseisrvgttvyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslkpedtavyycnalqyekhggadywgqgtlvtvss(seq id no:46)。

8、在一些实施方案中，抗体或其片段包括以下序列：evqlvesggglvkpggslrlscaasgrpvsnyaaawfrqapgkerefvsainwqktatyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycaavfrvvapktqydydywgqgtlvtvssggggdggggdggggevqlvesggglvqaggslrlscaasgrissiihmawyrqapgkqrelvaeisrvgttvyadsvkgrftisrddakntvtlqmnslkpedtavyycnalqyekhggadywgqgtqvtvss(seq id no:47)。

9、在一些实施方案中，抗体或其片段包括以下序列：evqlvesggglvkpggslrlscaasgrpvsnyaaawfrqapgkerefvsainwqktatyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycaavfrvvapktqydydywgqgtlvtvssggggeggggeggggevqlvesggglvqaggslrlscaasgrissiihmawyrqapgkqrelvaeisrvgttvyadsvkgrftisrddakntvtlqmnslkpedtavyycnalqyekhggadywgqgtqvtvss(seq id no:48)。

10、在一些实施方案中，抗体或其片段包括以下序列：evqlvesggglvkpggslrlscaasgrpvsnyaaawfrqapgkerefvsainwqktatyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycaavfrvvapktqydydywgqgtlvtvssggggsggggsggggsevqlvesggglvqpggslrlscaasgrissiihmawvrqapgkqrelvseisrvgttvyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycnalqyekhggadywgqgtlvtvss(seq id no:49)。

11、在一些实施方案中，抗体或其片段包括以下序列：evqlvesggglvkpggslrlscaasgrpvsnyaaawfrqapgkerefvsainwqktatyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycaavfrvvapktqydydywgqgtlvtvssggggdggggdggggevqllesggglvqpggslrlscaasgrissiihmawfrqapgkerelvseisrvgttvyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslkpedtavyycnalqyekhggadywgqgtlvtvss(seq id no:50)。

12、在一些实施方案中，抗体或其片段包括以下序列：evqlvesggglvkpggslrlscaasgrpvsnyaaawfrqapgkerefvsainwqktatyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycaavfrvvapktqydydywgqgtlvtvssggggeggggeggggevqllesggglvqpggslrlscaasgrissiihmawfrqapgkerelvseisrvgttvyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslkpedtavyycnalqyekhggadywgqgtlvtvss(seq id no:51)。

13、在一些实施方案中，抗体或其片段包括以下序列：evqlvesggglvkpggslrlscaasgrpvsnyaaawfrqapgkerefvsainwqktatyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycaavfrvvapktqydydywgqgtlvtvssggggdggggdggggevqlvesggglvqpggslrlscaasgrissiihmawvrqapgkqrelvseisrvgttvyadsvkgrftisrdnskntlylqmnslraedtavyycnalqyekhggadywgqgtlvtvss(seq id no:52)。

14、在一些实施方案中，抗体或其片段包括以下序列：levqlvesggglvqaggslrlscaasgrissiihmawyrqapgkqrelvaeisrvgttvyadsvkgrftisrddakntvtlqmnslkpedtavyycnalqyekhggadywgqgtqvtvssrkccvecppcpappvagpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvsqedpevqfnwyvdgvevhnaktkpreeqfnstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkglpssiektiskakgqprepqvytlppsqeemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflysrltvdksrwqegnvfscsvmhealhnhytqkslslslgk(seq id no:53)。

15、在一些实施方案中，抗体或其片段是与没有c1q结合结构域的hg1连接的lvp058抗备解素单价抗体vhh，并且包括以下序列：levqlvesggglvqaggslrlscaasgrissiihmawyrqapgkqrelvaeisrvgttvyadsvkgrftisrddakntvtlqmnslkpedtavyycnalqyekhggadywgqgtqvtvsspkscdkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykcavsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsreemtknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk(seq id no:54)。

16、在一些实施方案中，抗体或其片段是通过(g4s)3接头与抗白蛋白vhh连接的lvp058抗备解素单价抗体vhh，并且包括以下序列：levqlvesggglvqaggslrlscaasgrissiihmawyrqapgkqrelvaeisrvgttvyadsvkgrftisrddakntvtlqmnslkpedtavyycnalqyekhggadywgqgtqvtvssggggsggggsggggsevqlvesggglvkpggslrlscaasgrpvsnyaaawfrqapgkerefvsainwqktatyadsvkgrftisrdnaknslylqmnslraedtavyycaavfrvvapktqydydywgqgtlvtvss(seq id no:55)。

17、定义

18、如本文所用，术语“单价抗体或其抗体片段”是指抗体或其抗原结合片段，其包含抗原的单个结合结构域，例如vh或vhh，例如单个备解素分子。在一个实施方案中，结合的抗原分子是多聚体的一部分，例如，备解素单体的三聚体或更高级多聚体。通常，抗体，包括单价抗体或其抗体片段，以特异性抗原的高度特异性结合。

19、如本文所用，术语“单结构域抗体”定义其中抗原结合位点存在于单个免疫球蛋白结构域上并由其形成的分子。通常，免疫球蛋白单可变结构域的抗原结合位点由不超过三个cdr形成。单可变结构域可以例如包括轻链可变结构域序列(vl序列)或其合适的片段；或重链可变域序列(例如，vh序列或vhh序列)或其合适片段；只要它能够形成单个抗原结合单位(即，基本上是单可变结构域的功能性抗原结合单位，使得单个抗原结合结构域不需要与另一个可变结构域相互作用以形成功能性抗原约束单位)。

20、如本文所用，术语“骆驼科动物抗体”是指衍生自骆驼科动物的抗体，例如，在骆驼、单峰骆驼、美洲驼、羊驼或原驼中。骆驼科动物抗体与大多数其他哺乳动物的抗体不同之处在于它们缺乏轻链，因此仅包括具有完整和多样的抗原结合能力的重链(hamers-casterman,c.et al.,nature,363:446-8,1993)。

21、如本文所用，术语“vhh”是指缺乏轻链的单个重链可变结构域抗体。例如，vhh链可以是可以在天然缺乏轻链的骆驼科或软骨鱼中发现的类型，或者是可以相应构建的合成和非免疫vhh中发现的类型。每条重链包括由v-、d-和j外显子编码的可变区。vhh可以是天然vhh抗体，例如骆驼科动物抗体，或包含重链可变结构域的重组蛋白。

22、如本文所用，术语“分离的抗体”是指基本上不含具有不同抗原特异性的其他抗体的抗体(例如，与备解素结合的分离的抗体基本上不含污染物，例如，不结合备解素的抗体)。另外，“分离的”抗体是已经从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是可能干扰抗体的诊断或治疗用途的材料，并且可以包括酶、激素和其他蛋白质或非蛋白质溶质。

23、如本文所用，术语抗体或其片段，多肽或肽模拟物的“特异性结合”是与靶分子结合，所述靶分子与不是靶分子的分子的结合可测量地不同。如本文所用，特异性结合是指结合特定抗原相对于背景(“非特异性”)结合的优先级(preference)大于95％。“基本上特异性”结合是指结合特定抗原相对於背景结合的优先级大于约80％。结合可以使用多种方法测量，包括但不限于蛋白质印迹(western blot)、免疫印迹(immunoblot)、酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay)(“elisa”)、放射免疫测定(radioimmunoassay)(“ria”)、免疫沉淀(immunoprecipitation)、表面等离子体共振(surface plasmonresonance)、生物层干涉测量(bio-layer interferometry)、化学发光(chemiluminescence)、荧光偏振(fluorescent polarization)、磷光(phosphorescence)、免疫组织化学分析(immunohistochemical analysis)、基质辅助激光解吸/电离飞行时间(“maldi-tof”)质谱(matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flightmass spectrometry)、微量测定(microcytometry)、微阵列(microarray)、显微镜(microscopy)、荧光激活细胞分选(fluorescence activated cell sorting)(“facs”)和流式细胞术(flow cytometry)。

24、如本文所用，术语“人备解素”是指在血浆中发现的469个氨基酸的可溶性糖蛋白，其具有7个血小板反应蛋白i型重复序列(thrombospondin type i repeat)(tsr)，其中n-末端结构域tsr0是截短的结构域。人备解素，53kda蛋白质，包括信号肽(氨基酸1-28)和六个不相同的tsr重复序列，每个约60个氨基酸，如下：氨基酸80-134(tsr1)，氨基酸139-191(tsr2)，氨基酸196-255(tsr3)，氨基酸260-313(tsr4)，氨基酸318-377(tsr5)和氨基酸382-462(tsr6)。通过将棒状单体寡聚化(oligomerization)成环状二聚体、三聚体和四聚体形成备解素。人备解素的氨基酸序列在genbank数据库中以下列登录号找到：对于人备解素，参见例如genbank登录号aaa36489、np-002612、aah15756、aap43692、s29126和caa40914。备解素是替代补体激活级联(activation cascade)的正调节剂。用于备解素的已知结合配体包括c3b、c3bb和c3bbb(blatt,a.et al.,immunol.rev.,274:172 90,2016)。

25、如本文所用，术语“小鼠备解素(mouse properdin)”是指在血浆中发现的457个氨基酸可溶性糖蛋白，其具有7个tsr，其中n-末端结构域tsr0被截短。小鼠备解素，50kda蛋白质，包括信号肽(氨基酸1-24)和6个不同的tsr，每个约60个氨基酸，如下：氨基酸73-130(tsr1)、氨基酸132-187(tsr2)、氨基酸189-251(tsr3)、氨基酸253-309(tsr4)、氨基酸311-372(tsr5)和氨基酸374-457(tsr6)。小鼠备解素通过棒状单体的寡聚化形成环状二聚体、三聚体和四聚体。小鼠备解素的氨基酸序列例如在genbank数据库(genbank登录号p11680和s05478)中找到。

26、如本文所用，术语“tsr0结构域”是指备解素的截短结构域，其在备解素的tsr1结构域之前。例如，人备解素的tsr0结构域包括氨基酸28-76。

27、如本文所用，术语“tsr1结构域”是指与备解素的tsr0结构域相邻的备解素结构域。例如，人备解素的tsr0结构域包括氨基酸77-134。

28、如本文所用，术语“备解素的活性”是指备解素的生物活性，包括但不限于导致c3/c5转化酶稳定性的结合相互作用。备解素最强烈地结合c3b，bb-替代途径c3/c5转化酶，但也与c3b、c3b,b和c3b,bb结合。一个功能是稳定c3b,bb复合物，以允许增加的替代途径激活(pangburn,m.,methods enzymol.,162:639-53,1988；nolan,k.&reid,k.,methodsenzymol.,223:35-46,1993)。备解素通过增加因子b与p、c3b复合物的结合来增强替代途径c3转化酶的形成。因此，备解素是补体激活的加速剂(正调节剂)。备解素还涉及通过结合靶表面并启动c3/c5转化酶形成来启动替代途径的激活(kemper c.&hourcade,d.,mol.immunol.,45:4048-56,2008)。

29、如本文所用，术语“替代补体途径”是指补体激活的三种途径之一(其他途径是经典途径和凝集素途径)。替代补体途径通常由细菌、寄生虫、病毒或真菌激活，尽管据报道iga抗体和某些igl链也激活该途径。

30、如本文所用，术语“替代补体途径失调”是指替代补体途径提供针对病原体和清除免疫复合物和受损细胞的宿主防御以及用于免疫调节的能力的任何异常。替代补体途径失调可以在液相和细胞表面发生，并且可以导致过度的补体激活或不充分的调节，两者都引起组织损伤。

31、如本文所用，术语“由替代补体途径失调介导的疾病”是指由替代补体途径失调引起的身体功能、系统或器官的中断、停止或紊乱。这些疾病将受益于用本文所述的组合物或制剂治疗。在一些实施方案中，所述疾病由替代补体途径提供针对病原体和清除免疫复合物和受损细胞的宿主防御以及用于免疫调节的能力的任何异常引起。本文还包括直接或间接通过替代补体途径的一种或多种组分的失调或由替代补体途径产生的产物介导的疾病。

32、如本文所用，术语“替代补体途径依赖性膜攻击复合物组装”是指由于替代补体途径活化而形成的末端复合物，并且包括补体成分c5、c6、c7、c8和c9。膜攻击复合物(mac)的组装导致细胞裂解(lysis)。

33、如本文所用，术语“替代补体途径依赖性溶血”是指通过增加的替代补体途径依赖性mac组装和/或在红细胞上沉积介导的红细胞裂解。

34、如本文所用，术语“接头”是指两个元件(例如蛋白质结构域)之间的连接。接头可以是共价键或间隔(spacer)。术语“键”是指化学键，例如酰胺键或二硫键，或由化学反应产生的任何种类的键，例如化学共轭。接头可以指两个多肽或多肽结构域之间发生的部分(例如，聚乙二醇(peg)聚合物)或氨基酸序列(例如，3-200个氨基酸、3-150个氨基酸或3-100个氨基酸序列)，用于在两个多肽或多肽结构域之间提供空间和/或灵活性。氨基酸间隔可以是多肽一级序列(primary sequence)的一部分(例如，通过多肽主链与间隔的多肽或多肽结构域连接)。接头可包含一个或多个甘氨酸和丝氨酸残基。