通过招募剪接体组分进行RNA编辑的制作方法

背景技术：

1、长期以来存在替换致病rna序列的需求，但尚未得到满足。本公开提供了用于替换人细胞中rna分子中的特定rna序列的组合物和方法。在某些方面，本公开提供了用于替换靶rna内的所选定的rna序列的组合物和方法。在一些实施方式中，本公开提供了与工程改造的小核rna结合使用的rna供体分子，其将剪接体的组分招募至rna供体并促进靶rna的编辑以在人基因治疗的背景下治疗疾病。

2、人遗传疾病的有效治疗需要高效替换人细胞中的缺陷的遗传序列。rna编辑已被提议作为人基因治疗方法，但由于rna编辑效率低且大小和组成有限，在临床试验中尚未取得成功。此外，使用免疫原性蛋白质来编辑rna和dna也带来了安全问题。本公开描述了对rna编辑的改进，能够解决这一长期存在但未得到满足的需求。

技术实现思路

1、在某些方面，本文公开了一种组合物，其包含工程改造的小核rna和rna供体分子，所述工程改造的小核rna促进靶rna分子的反式剪接。在一些实施方式中，所述rna供体分子包含工程改造的小核rna结构域。在一些实施方式中，所述工程改造的小核rna分子来源于或分离自人小核rna基因，所述人小核rna基因选自下组：u1、u2、u4、u5、u6、u7、u11和u12。在一些实施方式中，所述工程改造的小核rna分子来源于或分离自u1小核rna基因或u1小核rna基因的变体，且包含rna基序，所述rna基序起始自距离5’端小于16个核碱基处，其与所述rna供体分子部分或完全互补。在一些实施方式中，所述工程改造的小核rna分子包含rna基序，所述rna基序与所述rna供体分子部分或完全互补。在一些实施方式中，rna基序选自下组：5’-cgagctctct-3’、5’-aacgagctct-3’、5’-cgcaacgagc-3’、5’-tatcgcaacg-3’、5’-aataatatcg-3’、5’-taagagagct-3’、5’-aagagagctc-3’、5’-agagagctcgttgc-3’、5’-gagagctcgt-3’、5’-agagctcgttgcga-3’和5’-gagctcgttg-3’。在一些实施方式中，所述工程改造的小rna分子包含来源于或分离自u1小核rna基因或u1小核rna基因的变体的序列。在一些实施方式中，所述工程改造的小rna分子包含来源于或分离自u1小核rna基因和u1小核rna基因的变体的序列。在一些实施方式中，所述u1小核rna基因的变体选自下组：vu1.4、vu1.11、vu1.8、vu1.7、vu1.5和vu1.12。在一些实施方式中，所述小核rna分子包括rna、dna、dna/rna杂交体、核酸类似物、化学修饰的核酸或两种或更多种核酸或核酸类似物构成的嵌合体。在一些实施方式中，rna供体分子还包含增强翻译的非翻译区。在一些实施方式中，所述组合物还包含增强所述rna供体分子和靶rna分子之间相互作用并增加反式剪接效率的rna结合蛋白。在一些实施方式中，工程改造的小核rna分子包含rna基序，所述rna基序长度至少为4个核苷酸，且与所述rna供体分子中的序列部分或完全互补。在一些实施方式中，rna基序选自下组：5’-cgagctctct-3’、5’-aacgagctct-3’、5’-cgcaacgagc-3’、5’-tatcgcaacg-3’、5’-aataatatcg-3’、5’-taagagagct-3’、5’-aagagagctc-3’、5’-agagagctcgttgc-3’、5’-gagagctcgt-3’、5’-agagctcgttgcga-3’和5’-gagctcgttg-3’。在一些实施方式中，rna供体分子包含rna基序，所述rna基序长度至少为4个核苷酸，且与所述rna供体分子中的序列部分或完全互补。在一些实施方式中，rna供体分子还包含增强翻译的非翻译区。在一些实施方式中，增强翻译的元件包括来源于或分离自下组的序列：土拨鼠肝炎病毒(whv)转录后调控元件(wpre)、来自malat1的三链体、乙肝病毒的pre(hpre)和铁反应元件。在一些实施方式中，所述组合物还包含增强所述rna供体分子和靶rna分子之间相互作用并增加反式剪接效率的rna结合蛋白。在一些实施方式中，rna供体分子包括rna、dna、dna/rna杂交体、核酸类似物、化学修饰的核酸或两种或更多种核酸或核酸类似物构成的嵌合体。在一些实施方式中，核酸分子还包含异源启动子。在一些实施方式中，本文描述了一种载体，其包含本文公开的权利要求所述的组合物。在一些实施方式中，载体选自下组：腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、纳米颗粒、胶束、脂质体、脂质复合物、聚合体、多聚复合物和树枝状分子。在一些实施方式中，本文公开了一种细胞，其包含本文所述的载体。在一些实施方式中，本文描述了一种治疗疾病的方法，所述方法包括给予有需要的患者治疗有效量的治疗，所述治疗包括本文所述组合物或本文所述载体。在一些实施方式中，本文描述了一种修正对象的遗传缺陷的方法，所述方法包括给予所述对象如本文所述的组合物或本文所述的载体。在一些实施方式中，本文描述了一种治疗疾病的方法，所述方法包括给予有需要的患者治疗有效量的治疗，所述治疗为本文所述组合物或本文所述载体。在一些实施方式中，本文描述了一种修正对象的遗传缺陷的方法，所述方法包括给予所述对象如本文所述的组合物或本文所述的载体。

2、在某些方面，本文公开了一种组合物，其包含工程改造的小核rna和rna供体分子，所述工程改造的小核rna促进靶rna分子的反式剪接，所述rna供体分子包含：(a)一个或多个替换结构域，其编码治疗性序列，操作性地连接至；(b)一个或多个内含子结构域，其促进所述替换结构域的rna剪接；和(c)一个或多个反义结构域，其促进与靶rna分子的结合。在一些实施方式中，所述rna供体分子包含工程改造的小核rna结构域。在一些实施方式中，所述工程改造的小核rna分子来源于或分离自人小核rna基因，所述人小核rna基因选自下组：u1、u2、u4、u5、u6、u7、u11和u12。在一些实施方式中，所述工程改造的小核rna分子来源于或分离自u1小核rna基因或u1小核rna基因的变体，且包含rna基序，所述rna基序起始自距离5’端小于16个核碱基处，其与所述rna供体分子部分或完全互补。在一些实施方式中，所述工程改造的小核rna分子包含rna基序，所述rna基序与所述rna供体分子部分或完全互补。在一些实施方式中，rna基序选自下组：5’-cgagctctct-3’、5’-aacgagctct-3’、5’-cgcaacgagc-3’、5’-tatcgcaacg-3’、5’-aataatatcg-3’、5’-taagagagct-3’、5’-aagagagctc-3’、5’-agagagctcgttgc-3’、5’-gagagctcgt-3’、5’-agagctcgttgcga-3’和5’-gagctcgttg-3’。在一些实施方式中，所述工程改造的小rna分子包含来源于或分离自u1小核rna基因或u1小核rna基因的变体的序列。在一些实施方式中，所述工程改造的小rna分子包含来源于或分离自u1小核rna基因和u1小核rna基因的变体的序列。在一些实施方式中，所述u1小核rna基因的变体选自下组：vu1.4、vu1.11、vu1.8、vu1.7、vu1.5和vu1.12。在一些实施方式中，所述小核rna分子包括rna、dna、dna/rna杂交体、核酸类似物、化学修饰的核酸或两种或多种核酸或核酸类似物构成的嵌合体。在一些实施方式中，rna供体分子还包含增强翻译的非翻译区。在一些实施方式中，所述组合物还包含增强所述rna供体分子和靶rna分子之间相互作用并增加反式剪接效率的rna结合蛋白。在一些实施方式中，工程改造的小核rna分子包含rna基序，所述rna基序长度至少为4个核苷酸，且与所述rna供体分子中的序列部分或完全互补。在一些实施方式中，rna基序选自下组：5’-cgagctctct-3’、5’-aacgagctct-3’、5’-cgcaacgagc-3’、5’-tatcgcaacg-3’、5’-aataatatcg-3’、5’-taagagagct-3’、5’-aagagagctc-3’、5’-agagagctcgttgc-3’、5’-gagagctcgt-3’、5’-agagctcgttgcga-3’和5’-gagctcgttg-3’。在一些实施方式中，rna供体分子包含rna基序，所述rna基序长度至少为4个核苷酸，且与所述rna供体分子中的序列部分或完全互补。在一些实施方式中，rna供体分子还包含增强翻译的非翻译区。在一些实施方式中，增强翻译的元件包括来源于或分离自下组的序列：土拨鼠肝炎病毒(whv)转录后调控元件(wpre)、来自malat1的三链体、乙肝病毒的pre(hpre)和铁反应元件。在一些实施方式中，所述组合物还包含增强所述rna供体分子和靶rna分子之间相互作用并增加反式剪接效率的rna结合蛋白。在一些实施方式中，rna供体分子包括rna、dna、dna/rna杂交体、核酸类似物、化学修饰的核酸或两种或更多种核酸或核酸类似物构成的嵌合体。在一些实施方式中，核酸分子还包含异源启动子。在一些实施方式中，本文描述了一种载体，其包含本文公开的权利要求所述的组合物。在一些实施方式中，载体选自下组：腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、纳米颗粒、胶束、脂质体、脂质复合物、聚合体、多聚复合物和树枝状分子。在一些实施方式中，本文公开了一种细胞，其包含本文所述的载体。在一些实施方式中，本文描述了一种治疗疾病的方法，所述方法包括给予有需要的患者治疗有效量的治疗，所述治疗包括本文所述组合物或本文所述载体。在一些实施方式中，本文描述了一种修正对象的遗传缺陷的方法，所述方法包括给予所述对象如本文所述的组合物或本文所述的载体。在一些实施方式中，本文描述了一种治疗疾病的方法，所述方法包括给予有需要的患者治疗有效量的治疗，所述治疗为本文所述组合物或本文所述载体。在一些实施方式中，本文描述了一种修正对象的遗传缺陷的方法，所述方法包括给予所述对象如本文所述的组合物或本文所述的载体。

3、在某些方面，本文公开了一种包含rna供体分子的组合物，其包含：(a)一个或多个替换结构域，其编码治疗性序列，操作性地连接至；(b)一个或多个内含子结构域，其促进所述替换结构域的rna剪接；和(c)一个或多个反义结构域，其促进与靶rna分子的结合；以及(d)工程改造的小核rna结构域，所述工程改造小核rna结构域促进所述rna供体分子的反式剪接。在一些实施方式中，所述工程改造的小核rna结构域位于距离所述rna供体分子中剪接供体位点小于200个碱基处。在一些实施方式中，所述工程改造的小核rna结构域分离自或来源于人小核rna基因。在一些实施方式中，人小核rna基因选自下组：u1、u2、u4、u5、u6、u7、u11和u12。在一些实施方式中，其中所述工程改造的小核rna结构域是合成的，并与剪接体的组分结合。在一些实施方式中，工程改造的小核rna结构域包括分离自或来源于人u1基因的变体的序列。在一些实施方式中，所述工程改造的小核rna结构域包含来源于人u1小核rna基因和u1小核rna基因的变体的序列。在一些实施方式中，rna供体分子还包含增强翻译的非翻译区。在一些实施方式中，所述组合物还包含增强所述rna供体分子和靶rna分子之间相互作用并增加反式剪接效率的rna结合蛋白。在一些实施方式中，工程改造的小核rna分子包含rna基序，所述rna基序长度至少为4个核苷酸，且与所述rna供体分子中的序列部分或完全互补。在一些实施方式中，rna基序选自下组：5’-cgagctctct-3’、5’-aacgagctct-3’、5’-cgcaacgagc-3’、5’-tatcgcaacg-3’、5’-aataatatcg-3’、5’-taagagagct-3’、5’-aagagagctc-3’、5’-agagagctcgttgc-3’、5’-gagagctcgt-3’、5’-agagctcgttgcga-3’和5’-gagctcgttg-3’。在一些实施方式中，rna供体分子包含rna基序，所述rna基序长度至少为4个核苷酸，且与所述rna供体分子中的序列部分或完全互补。在一些实施方式中，rna供体分子还包含增强翻译的非翻译区。在一些实施方式中，增强翻译的元件包括来源于或分离自下组的序列：土拨鼠肝炎病毒(whv)转录后调控元件(wpre)、来自malat1的三链体、乙肝病毒的pre(hpre)和铁反应元件。在一些实施方式中，所述组合物还包含增强所述rna供体分子和靶rna分子之间相互作用并增加反式剪接效率的rna结合蛋白。在一些实施方式中，rna供体分子包括rna、dna、dna/rna杂交体、核酸类似物、化学修饰的核酸或两种或更多种核酸或核酸类似物构成的嵌合体。在一些实施方式中，核酸分子还包含异源启动子。在一些实施方式中，本文描述了一种载体，其包含本文公开的权利要求所述的组合物。在一些实施方式中，载体选自下组：腺相关病毒、逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、纳米颗粒、胶束、脂质体、脂质复合物、聚合体、多聚复合物和树枝状分子。在一些实施方式中，本文公开了一种细胞，其包含本文所述的载体。在一些实施方式中，本文描述了一种治疗疾病的方法，所述方法包括给予有需要的患者治疗有效量的治疗，所述治疗包括本文所述组合物或本文所述载体。在一些实施方式中，本文描述了一种修正对象的遗传缺陷的方法，所述方法包括给予所述对象如本文所述的组合物或本文所述的载体。在一些实施方式中，本文描述了一种治疗疾病的方法，所述方法包括给予有需要的患者治疗有效量的治疗，所述治疗为本文所述组合物或本文所述载体。在一些实施方式中，本文描述了一种修正对象的遗传缺陷的方法，所述方法包括给予所述对象如本文所述的组合物或本文所述的载体。

4、通过引用纳入

5、本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请通过引用纳入本文，就好像将各篇单独的出版物、专利或专利申请专门和单独地通过引用纳入本文那样。