一种非整倍体及拷贝数变异无创产前检测试剂、装置及应用的制作方法

本发明涉及生物，特别是基因测序领域。具体地，本发明涉及一种非整倍体及拷贝数变异无创产前检测试剂、装置及应用，可用于非整倍体及拷贝数变异无创产前检测。

背景技术：

1、无创产前dna检测技术（non-invasive prenatal testing，nitp）是一种基于孕妇外周血血浆中胎儿来源游离dna（cffdna）的新型产前筛查技术。主要筛查疾病包括唐氏综合征（t21）、爱德华氏综合征（t18）、帕陶氏综合征（t13）、性染色体非整倍体及部分染色体拷贝数变异。该技术通过采集孕妇静脉血，分离血浆并提取血浆中的游离dna（即cfdna）制备测序文库，借助于高通量基因测序方法进行深度测序，同时结合生物信息学分析技术，评估胎儿患染色体异常疾病的风险。目前，无创产前基因检测已经在临床上广泛应用，降低了孕妇因过度的侵入性产前诊断而导致的流产风险，同时提高了胎儿染色体非整倍体疾病的检出率，降低了检测的假阳性率。此外，nipt还应用于单基因遗传病检测，可直接检测胎儿是否携带致病基因；同时，还可以应用在染色体微缺失/微重复检测方面。染色体微缺失／微重复是除染色体非整倍体之外的另一大引起新生儿出生缺陷的遗传性因素，是一类由于染色体拷贝数变异(copy number variation， cnv)而导致的具有复杂临床表型的综合征性疾病。研究表明，在高测序深度、高胎儿游离dna浓度的情况下，nipt可用于检测胎儿染色体微缺失重复检测。

2、由此可知，nipt在染色体非整倍体疾病、单基因遗传病检测、染色体微缺失/微重复检测等方面，其最终检测靶标都是孕妇外周血血浆中全部游离dna中的胎儿游离dna（即cffdna）部分。其检测的准确性会受到孕妇外周血血浆中全部游离dna中胎儿游离dna占比的影响。通常情况下，孕妇外周血游离dna中胎儿游离dna占比非常低，这种占比对nipt等后续检测策略构成相当大的挑战，再加上不同母体个体间差异、实验操作误差以及样本质量等因素的影响，检测样本中胎儿游离dna的含量极大地影响了相关检测的效率和准确性。在检测策略中，提高待检样本中胎儿游离dna的占比，即提高待检样本中靶标胎儿游离dna的浓度，可有效降低母源性游离dna带来的背景噪音数据对检测结果的影响，提高检测结果的准确性，降低检测结果假阴性、假阳性的发生率。同时，优化检测方法中待检样本胎儿游离dna的浓度还可以减小对后续建库试剂体系和高通量测序数据量的需求，有利于降低检测成本。

3、因此，有必要开发一种非整倍体及拷贝数变异无创产前检测试剂，稳定而有效地降低无创产前检测结果中假阴性假阳性的发生率，减少检测过程中实际残留对结果的影响，提高检测的效率和稳定性，降低检测成本。

技术实现思路

1、需要说明的是，本发明是基于发明人的下列研究和发现才完成的：

2、本发明发现，孕妇外周血血浆中婴儿来源游离dna部分片段大小与母源游离dna片段大小存在差异，其全部游离dna片段大小峰值约为166bp，而胎儿游离dna片段则较小，约为143bp。基于这一发现，可实现通过使用对不同片段大小的dna具有不同回收效率的片段筛选方案有针对性地实现富集孕妇血浆全部游离dna中150bp以下的小片段部分，去除大片段部分（根据检测目标的不同，所述的大片段与小片段的区分阈值n取值不同），从而提高胎儿游离dna在全部游离dna中的占比。由此也可见，胎儿游离dna的富集过程中核心环节应当为大片段去除（或小片段富集）步骤。该步骤的高回收精度、稳定的大片段的去除（或小片段富集）能力可在很大程度稳定而有效地提高下游产出待检样本中胎儿游离 dna的浓度。

3、在具体实施方式中，在使用现有的dna片段筛选方案（包括但不限于二氧化硅吸附/洗脱、凝胶电泳、固相可逆吸附等）来富集胎儿游离dna，均存在富集效果的稳定性差以及富集后游离dna的回收效率不足的问题。在一具体实施例中首先使用高结合力的羟基磁珠提取孕妇血浆样本，获得全部游离dna溶液。然后，使用高效的片段筛选纯化试剂富集所得全部游离dna溶液以获得富集胎儿游离dna的提取产物。但该方案针对相同样本的平行实验结果，呈现出显著的不稳定性，说明该方案存在富集稳定性差的问题。分析发现其中采用将固定体积的游离dna溶液与一定比例的固定体积的羧基磁珠溶液混合，达到对不同片段具有不同纯化效率的反应体系，结合大片段dna与羧基磁珠上，保留小片段dna于溶液中。但这一过程对于片段大小的回收效率差异精确依赖dna溶液与磁珠溶液混合后的体系中的有效分子浓度有关（包括但不限于peg浓度，盐离子浓度等），这一有效分子浓度取决于最终反应溶液中的自由水含量以及大分子peg含量、阳离子含量的比例。因此如果想要达到高精度高稳定性的大片段去除效果，就高度依赖两个因素：1）液体混合过程中的取样体积的精度和稳定；2）提取产物dna溶液中的自由水含量。但在实际操作中，这两种因素会受液相残留（例如：乙醇、清洗液等）、液体间混合体积变化、吸取移液操作的精确性和稳定性等的影响。例如：1）液体混合体积的准确性及精密度的问题。在实际实验操作中，实验过程种会因移液器具自身的精度以及操作的波动性，具有不可避免的随机误差以及可能的人为失误。导致大片段去除步骤反应液浓度在传统流程下的固有精度受到限制，无法消除操作带来的误差，进而不能保证筛选效果及筛选效果稳定性。2）在提取实验过程中，提取产物游离dna溶液在进行最后的洗脱步骤前需要高浓度醇溶液漂洗去除多余的杂质及离子，并在洗脱前将漂洗也去除。但是因为移液系统无法精密全部去除容器内溶液，一般会采用晾干的方式以最终去除。但这一过程在实际操作过程中，会因为液体去除操作的不完全，或晾干过程的不充分（晾干不充分在核酸提取中是常见的，因为过度的晾干操作会导致磁珠板结，影响后续核酸洗脱效果），导致提取产物核酸溶液中总会或多或少的残留不同程度的漂洗液。这部分漂洗液的存在，会使得大片段去除步骤选取固定体积溶液混合时，其中真正的自有水含量比例存在不确定性，导致大片段去除步骤体系浓度（水基质溶液）产生误差，不能保证筛选效果及筛选效果稳定性，从而导致后续检测结果的不稳定以及假阳性、假阴性率的上升。

4、在具体实施方式中，在游离dna洗脱过程中，容器吸附、磁珠浸入等原因不可避免地导致部分游离dna溶液形成无法被移液器吸取的死体积，无法进入后续片段筛选过程，进而造成的游离dna损失。此问题可以通过增大洗脱体积的方式来降低死体积占比，但大片段去除步骤中混合后筛选体系所需的倍数于待筛选核酸液相（即游离dna提取过程中的洗脱体系）的混合比例，使得下游体系限制了游离dna提取过程中的洗脱体系的体积上限，继而限制了核酸片段富集回收率，从而限制了下游检测的效率。

5、在具体实施方式中，应用于提高非整倍体及拷贝数变异无创产前检测靶标胎儿来源游离dna的浓度的方法，主要有四种：

6、液液混合磁珠片筛富集法：在实验流程中，增加磁珠片段筛选实验步骤，通过对不同片段大小的dna具有不同回收效率的片段筛选方案，将固定体积的dna溶液与一定比例的固定体积羧基磁珠核酸纯化试剂混合，富集全部游离dna片段中150bp以下的小片段部分，从而提高靶标胎儿来源游离dna的浓度。该种方案可以将靶标胎儿来源游离dna的浓度，提高2~3倍，可以较高程度的提升胎儿游离dna浓度；同时该种方案成本较低且可以实现大样本量自动化操作。但是因其实现方案高度依赖dna溶液体积与羧基磁珠核酸纯化试剂体积比例的混合精度，导致该种方案的精确度和稳定性不足。

7、电泳片段筛选富集法：在实验流程中，文库构建完成后，通过凝胶电泳和切胶回收富集小片段dna。该种富集方案可以将靶标胎儿来源游离dna的浓度，提高2~3倍，可以较高程度的提升胎儿游离dna浓度；且该种方案成本较低。但是由于dna片段大小较难精准判定，电泳法富集方案实验可重复性及精度较差；而且该种方案操作复杂容易造成样本间交叉污染，并难以实现大样本量自动化操作，不满足高通量检测需求。

8、生信片段截取富集法：在生信分析流程中，对双端测序数据，与基因组比对获得测序数据片段大小后，截取固定片段大小的小片段数据进行分析，达到富集全部游离dna片段中小片段部分测序数据的目的，从而提高靶标胎儿来源游离dna的浓度。该种方案可以高精度高稳定性的实现胎儿游离dna浓度提升；且该种方案不涉及实验流程，适用于大样本量高通量操作。但是该种方案如果想要实现接近液液混合磁珠片筛富集法的胎儿游离dna浓度提升倍数，需要舍弃全部150bp以上的测序数据，仅保留150bp以下的测序数据。根据孕妇外周血血浆中全部游离dna片段分布，150bp以上的游离dna占全部游离dna总量的80%以上，即需舍弃全部测序数据的80%以上，才能实现与液液混合磁珠片筛富集法等效的富集效果，即需要按照数据分析所需最低数据量5倍量进行高通量测序。在现阶段测序数据成本占nipt整体检测成本80%以上的成本条件下，该种胎儿游离dna富集方案成本过于昂贵。（例如cn113593629a，在所有测序数据中，将测序数据按插入片段大小排序，截取片段偏小的一半测序数据，该种截取方案，大片段去除效果不足，因此数据中胎儿浓度仅提升了20~50%，而且因为样本间差异，不同样本的截取效果会存在较大差异）。

9、pcr变性温度富集法：在实验流程中，控制pcr扩增步骤的变性温度，基于胎儿部分游离dna整体甲基化程度与母亲部分游离dna甲基化程度相比较低，以及低甲基化程度dna解链温度较低的原理，通过降低pcr扩增过程中的变性温度，选择性的扩增低甲基化片段，从而提高靶标胎儿来源游离dna的浓度。该种方案可将靶标靶标胎儿来源游离dna的浓度，提高10%~30%（例如cn115992202a）。该种方案操作便捷可实现大样本量高通量操作、成本低廉，但胎儿游离dna富集效果较低，较难满足检测性能提升需求。

10、 富集方案 富集效果 精度和稳定性 大样本量/高通量 成本 综合评价 液液混合磁珠片筛富集法 2~3倍 中 可实现 低 临床可用性较高，但稳定性不足 电泳片段筛选富集法 2~3倍 低 难以实现 低 低通量低稳定性，临床可用性较低 生信片段截取富集法 2~3倍 高 可实现 高 其他方案成本的3~5倍，临床可用性较低 pcr变性温度富集法 10%~30% / 可实现 低 富集效果不足，临床可用性较低

11、现阶段临床上主要使用液液混合磁珠片筛富集法进行胎儿部分游离dna的富集，辅以pcr变性温度富集法或截取部分测序数据的阉割版生信片段截取富集法进行进一步的胎儿部分游离dna的富集。

12、但是液液混合磁珠片筛富集法本身精确度和稳定性不足的问题，会造成一定的假阴性或假阳性检测结果。

13、现阶段无创产前检测临床上基本使用z检验方案（z＝(r-mean)/sd，z为当前待测样本的某个染色体或染色体窗口的检测值，r为当前待测样本获得的该染色体或染色体窗口比例值，mean为该染色体或染色体窗口的参考比例值，sd为该染色体或染色体窗口的参考比例值的标准差）进行非整倍体与拷贝数变异检测，z检验要求使用大量阴性样本建立背景数据库（mean值与sd值），待测样本的检测数据与背景数据库进行比较，比较与背景数据库的偏离程度，从而输出检测结果。该种与背景库比较的检检验方案，前提假设为背景库建立过程与待测样本检测过程，其实验流程与生信分析流程完全一致且检测批次间稳定性良好。

14、z值(z-score)，常用的阈值为3：当z的绝对值超过3时认为胎儿具有高风险。对于正常胎儿，z的绝对值基本是随机分布的，极少超过3，假阳性很低；而对于染色体拷贝数异常胎儿，z的绝对值受到胎儿dna浓度(即孕妇外周血中的胎儿来源的cfdna片段占母体血浆cfdna的分百分比)的影响，胎儿dna浓度越高时z的绝对值越高。如若胎儿cfdna浓度较低，有可能导致z的绝对值低于3而出现假阴性结果，并且在实际应用中会出现部分样本由于胎儿cfdna浓度过低而无法给出结果的情况，大约影响1％左右的孕妇。z的绝对值位于阈值附近的孕妇，一般会被要求进行二次检测。

15、但在常规的液液混合磁珠片筛富集cfdna的操作过程中，若不同实验批次间磁珠片段筛选稳定性不足，会导致片段筛选效果出现差异，而该种片段筛选效果差异，在数据库建立过程中会造成背景数据库的偏移（mean值偏移，造成假阴性或假阳性结果）或精密度不足（sd值变大，导致待测样本z值绝对值变小，造成假阴性结果），在待测样本检测过程中会造成待测样本检测结果与背景数据库偏移（造成假阴性或假阳性结果）。从而导致假阳性或假阴性结果的产生。

16、为解决上述问题，本发明提供一种降低假阳性、假阴性结果的非整倍体及拷贝数变异无创产前检测方法，简并了孕妇血浆游离dna提取流程与胎儿游离dna筛选富集流程，在样本处理关节构建了一套双核分步式连续反应方案，以孕妇血浆为样本起始，实现稳定高效的获得胎儿游离dna占比提升的游离dna提取产物，并以该提取产物作为标靶构建检测文库，通过高通量测序以及后续生信分析获得非整倍体及拷贝数变异无创产前检测结果，该方法可根据下游检测需求通过调整核心试剂的比例，提高检测效率和稳定性，降低检测结果中假阴性、假阳性发生率。

17、因此，为了实现上述目的，在本发明的一方面提供：。

18、1.一种非整倍体及拷贝数变异无创产前检测试剂，包含核酸提取富集试剂、建库试剂和测序试剂，其特征在于，所述核酸提取富集试剂包含羟基结合部、羧基结合部；所述羟基结合部为带有羟基修饰集团的核酸结合载体；所述羧基结合部为带有羧基修饰基团的核酸结合载体。

19、2.根据项1所述的试剂，其特征在于，所述羟基结合部为羟基结合部为羟基磁珠、硅醇基磁珠、羟基玻璃珠中的任一种或多种；所述羧基结合部为羧基磁珠、羧基玻璃珠中的任一种或两种；优选地，所述羟基结合部为羟基磁珠；所述羧基结合部为羧基磁珠。

20、3.根据项2所述的试剂，其特征在于，所述羟基磁珠为包含20～80mg/ml羟基修饰磁珠的羟基磁珠悬浮液；优选地，所述羟基磁珠为包含30～60mg/ml羟基修饰磁珠的羟基磁珠悬浮液。

21、4.根据项2所述的试剂，其特征在于，所述羧基磁珠为含有peg和盐离子的碱性的羧基磁珠悬浮液；优选地，所述羧基磁珠悬浮液中peg选自peg6000～20000任一种或多种的组合；优选地，所述羧基磁珠悬浮液中peg选自peg8000～15000任一种或多种的组合；优选地，所述羧基磁珠悬浮液，其组成包含0.05～2重量％的羧基修饰磁珠，10～20重量％的peg6000～20000，1～4m的nacl，1～100mm的tris-hcl，以及0.1～10mm的edta，ph值为6.0～9.0；优选地，所述羧基磁珠悬浮液，其组成包含0.5～1.5重量％的羧基修饰磁珠，12～18重量％的peg10000，1～3m的nacl，1～50mm的tris-hcl，以及0.1～5mm的edta，ph值为7.0～9.0。

22、5.根据项1所述的试剂，其特征在于，所述核酸提取富集试剂还包含结合液；所述结合液为高浓度盐离子酸性溶液体系；优选地，所述结合液含有高浓度离液盐；优选地，所述高浓度离液盐，包含碘化钠、高氯酸钠、盐酸胍、异硫氰酸胍中的任一种或多种；优选地，所述高浓度离液盐，包含盐酸胍、异硫氰酸胍任一种或多种；优选地，所述结合液含有4~6m异硫氰酸胍，0.5~2m盐酸胍；优选地，所述结合液含有4.5~5.5m异硫氰酸胍，0.8~1.5m盐酸胍；优选地，所述结合液还含有表面活性剂、tris、edta；所述表面活性剂为非离子型表面活性剂；优选地，所述非离子型表面活性剂为tween20、triton-x100、sds、np40和聚氧乙烯中的一种或多种；优选地，所述结合液含有异硫氰酸胍、盐酸胍、tritonx-100、tris-hcl、edta；优选地，所述结合液含有4~6m异硫氰酸胍，0.5~2m盐酸胍，1~4重量% tritonx-100，50~100mm tris-hcl，ph5~6，5~10mm edta；优选地，所述结合液含有4.5~5.5m异硫氰酸胍，0.8~1.5m盐酸胍，2~3重量% tritonx-100，50~80mm tris-hcl，ph5~6，5~8mm edta.。

23、6.根据项1所述的试剂，其特征在于，所述核酸提取富集试剂，还包含第二羧基结合部；所述第二羧基结合部为带有羧基修饰基团的核酸结合载体；优选地，所述第二羧基结合部为羧基磁珠、羧基玻璃珠中的任一种或两种；优选地，所述第二羧基结合部为羧基磁珠。

24、7.根据项6所述的试剂，其特征在于，所述羧基磁珠部为含有peg和盐离子碱性的第二羧基磁珠悬浮液；所述第二羧基磁珠悬浮液中的peg和盐离子浓度大于羧基磁珠悬浮液；优选地，所述第二羧基磁珠悬浮液中peg选自peg6000～20000任一种或多种的组合；优选地，所述第二羧基磁珠悬浮液中peg选自peg8000～15000任一种或多种的组合；优选地，所述第二羧基磁珠悬浮液，其组成包括0.05～2重量％的羧基修饰磁珠，15～30重量％的peg6000～20000，1～4m的nacl，1～100mm的tris-hcl，以及0.1～10mm的edta，ph值为6.0～9.0；优选地，所述第二羧基磁珠悬浮液，其组成包括0.5～1.5重量％的羧基修饰磁珠，20～30重量％的peg10000，2～4m的nacl，1～50的tris-hcl，以及0.1～5mm的edta，ph值为7.0～9.0。

25、8.根据项1所述的试剂，其特征在于，所述核酸提取富集试剂，还包含第一清洗液和第二清洗液；所述第一清洗液含有离液盐、表面活性剂、tris、乙醇和/或异丙醇；所述第二清洗液包含70~80%乙醇；优选地，所述第一清洗液含有1~4m异硫氰酸胍，0.1~1m盐酸胍，1~3重量% tritonx-100，50~100mm tris，ph7~7.5，30-60%乙醇和/或异丙醇；所述第二清洗液包含75~80%乙醇；优选地，所述第一清洗液包含1~3m异硫氰酸胍，0.2~0.8m盐酸胍，1~2重量% tritonx-100，50~80m tris，ph7~7.5，30-50%乙醇和/或异丙醇。

26、9.根据项1所述的试剂，其特征在于，所述建库试剂包含缓冲液ⅰ和缓冲液ⅱ。所述缓冲液ⅰ包括：tris缓冲液、二价阳离子、一价阳离子、atp和dntp；所述缓冲液ⅱ包括：所述第二缓冲液包括：tris缓冲液、二硫苏糖醇和低分子量peg，且所述第二缓冲液不包括二价阳离子；优选地；所述缓冲液ⅰ包括：8~15mm的tris缓冲液、4~20mm的二价阳离子、40~200mm的一价阳离子、1~5mm的atp和0.5~5mm的dntp，ph8~10；和/或，所述缓冲液ⅱ包括：30~40mm的tris缓冲液、0.5~4mm的还原剂、7.5%~30%体积比的低分子量peg，ph7~9；基底为ddh2o。

27、10.根据项9所述的试剂，其特征在于，所述缓冲液ⅰ还包括表面活性剂，优选地，以缓冲液ⅰ的总重量为基准，所述表面活性剂的含量为0.01~2质量％；更优选地，所述表面活性剂选自聚乙二醇辛基苯基醚、tween 20、tween 40和tween 60中的至少一种。

28、11.根据项9-10所述的试剂，其特征在于，所述tris缓冲液为tris-盐酸缓冲液和/或tris-醋酸缓冲液；和/或，所述二价阳离子选自mg2+、mn2+和ca2+中的至少一种；和/或，所述低分子量peg的分子量为200-1000，更优选地，所述低分子量peg选自peg 200、peg400、peg 600、peg 800和peg 1000中的至少一种。

29、12.根据项9所述的试剂，其特征在于，在一些实施方式中，所述建库试剂，还包含用于末端修复和加腺苷酸尾处理的酶ⅰ，以及用于接头连接处理的酶ⅱ；优选地，所述酶ⅰ为dna聚合酶和加腺苷酸尾酶；更优选地，所述dna聚合酶为taqdna聚合酶和/或t4 dna聚合酶；所述加腺苷酸尾酶选自klenow(3’-5’exo-)、klenow fragement和t4 polynucleotidekinase中至少一种；优选地，所述第二酶为t4 dna ligase。

30、13.根据项1-11任一项所述试剂，在检测包括常染体非整倍体疾病、性染色体非整倍体疾病以及染色体拷贝数变异疾病中的任一种或多种组合的应用；优选地，所述常染体非整倍体疾病包括唐氏综合征（t21)、爱德华氏综合征（t18)、帕陶氏综合征（t13)中任一种或多种的组合；优选地，所述性染色体非整倍体疾病包括45x0、47xxy、47xyy、47xxx中任一种或多种的组合；优选地，所述染色体拷贝数变异疾病包括1p36缺失综合征、2q33.1缺失综合征、猫叫综合征、8p23.1重复综合征、8p23.1缺失综合征、langer-giedion综合征、11g23缺失综合征、15g26过度生长综合征、prader-willi综合征、angelman综合征、digeoge缺失综合征疾病中任一种或多种的组合。

31、本发明有益效果：

32、本发明提供一种非整倍体及拷贝数变异无创产前检测试剂、装置及应用，应用其构建的检测流程可根据下游检测需求选择性地提高所得游离dna提取产物中胎儿游离dna的占比。克服了液体混合体积的准确性及精密度的影响和提取产物游离dna溶液中的自由水含量的对富集稳定性的影响，提升了胎儿游离dna富集效果的精度和稳定性，减少组间操作的差异性，从而降低了非整倍体及拷贝数变异无创产前检测结果假阳性、假阴性的发生率。并且通过简并的提取与筛选富集流程克服了提取过程中游离dna溶液体积损失提升了胎儿游离dna富集提取产量，进而提升力检测的效率，降低检测成本。同时，通过优化试剂组分，克服检测流程中残留的胍盐、乙醇等对于构建测序的影响，进而提升最终检测结果的准确性。

33、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明 显，或通过本发明的实践了解到。