真菌免疫调节蛋白的制备方法及其应用

本发明属于生物基因工程，涉及一种真菌免疫调节蛋白的制备方法及其应用。

背景技术：

1、真菌免疫调节蛋白fips是继凝集素之后在大型食用真菌蘑菇中发现的另一类具有免疫调节和抗肿瘤活性的小分子蛋白。该类蛋白通过作用于免疫效应细胞，激发肌体先天或获得性免疫应答，诱导生物学效应物合成来行使其免疫调节和抗肿瘤功能。茯苓为多孔菌科真菌茯苓wolfporia cocos的干燥菌核，是中国的道地、大宗药材。茯苓因其性平、味苦、无毒，具有渗湿利水、防癌抗衰、增强机体免疫力的功效，被称为中国的四大原料药之一，临床中药处方中65％都有茯苓，也是当前国际药品市场最具潜力的天然药物之一。同时被国家卫生部、国家中药管理局列入“既是食品又是药品的品种名单”。茯苓中的主要成分为膳食纤维，其比例占茯苓干重的80％以上；其次为蛋白质，约占茯苓干重的1.5％。从茯苓干燥菌核中纯化得到一种免疫调节蛋白，该免疫调节蛋白被命名为pcp蛋白。体外试验显示该茯苓蛋白pcp能刺激raw 264.7巨噬细胞产生tnf-α与il-1β，同时亦能调控nf-κb相关基因的表达量。可见该真菌免疫调节蛋白fip在调节机体的免疫力方面具有重要的应用开发价值。

2、从食用菌中提取天然pcp，成本昂贵、耗时、产量少，每千克蘑菇只能提取毫克级蛋白。直接从菌体中提取很难获得大量的pcp，严重制约了其在临床和医药上的应用。因此，研究和建立高产稳定的pcp重组表达体系，成为必然的选择。现代分子生物学和生物工程技术的迅速发展，为利用工程菌株获得大量重组免疫调节蛋白提供了技术基础。在原核表达中，载体的选择对外源基因能否表达和表达量的高低产生着直接的影响。现有技术中将pcp构建表达载体，然后转化到e.coli进行表达，但得到的都是无活性的包涵体，通过在体外合适的条件下进行溶解、变性、复性和纯化，从每升培养基仅能得到微量的可溶性蛋白质，生产量低；目前，还没有通过改造茯苓pcp的dna序列且优化茯苓pcp表达纯化方法来高效生产重组蛋白的方式，极大影响了pcp在提高机体细胞免疫活性中的应用，因此需开发出一种可以降低成本、实现大量生产且具有生物活性茯苓pcp的方法。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明目的在于提供一种可高表达茯苓免疫调节蛋白的一种真菌免疫调节蛋白的重组菌，以及利用该重组菌制备蛋白的制备方法及其应用。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1、一种真菌免疫调节蛋白的重组菌，所述重组菌转化有重组载体，所述重组载体包括表达载体和真菌免疫调节蛋白基因，所述真菌免疫调节蛋白基因至少含有下列核苷酸序列之一的dna片段：

4、a.序列表中seq id no.1的核苷酸序列；

5、b.与seq id no.1所示核苷酸序列或至少具有90％、95％、96％、97％、98％或99％同源性且编码相同生物学功能蛋白质的核苷酸序列。

6、进一步，所述pcp蛋白基因至少含有下列核苷酸序列之一的dna片段：序列表中seqid no.1、seq id no.9、seq id no.10、seq id no.11的核苷酸序列。

7、进一步，所述重组载体由空载体和插入该空载体的目的基因组成，具体为将上述基因合成后直接插入表达空载体中，得到表达上述蛋白的重组载体。

8、进一步，重组表达载体的制备方法具体为：

9、(1)用xho i和xba i双酶切含真菌免疫调节蛋白基因的质粒，获得目的片断；

10、(2)用xho i和xba i双酶切表达载体，获得酶切载体；

11、(3)将步骤(1)和(2)得到的目的片断和酶切载体用dna凝胶进行回收；

12、(4)将步骤(3)回收得到的目的片断和酶切载体用t4dna连接酶进行连接反应，目的基因片段准确插入到含有分泌信号α-因子的分泌型载体读码框内。

13、所述表达载体为空载体pgapzαa。

14、进一步，重组表达载体的制备方法具体为，步骤1)中双酶切反应体系：含真菌免疫调节蛋白基因的质粒15μl，10×m缓冲液5μl，xho i 5u，xba i 5u，加无菌水至50μl；步骤2)中双酶切反应体系：表达载体15μl，10×m缓冲液5μl，xho i 5u，xba i 5u，加无菌水至50μl。

15、进一步，连接反应的反应体系如下：酶切载体1μl，目的片段3μl，10×缓冲液1μl，t4连接酶0.5μl，加无菌水至10μl。

16、进一步，所述重组菌的出发菌株为毕赤酵母菌。

17、进一步，所述毕赤酵母菌为x33、gs115或smd1168。

18、进一步，所述表达载体为pgapzαa。

19、2、一种重组活性pcp蛋白的制备方法，包括以下步骤：

20、1)将上述任一项所述的重组菌用2000μg/ml zeocin的ypd平板筛选得到高表达真菌免疫调节蛋白的转化子；

21、2)将步骤1)所得的高表达真菌免疫调节蛋白的转化子先用ypg培养基培养至一定浓度作为种子菌，再将种子菌接种含有无机盐培养基的发酵罐中进行发酵；

22、3)在25～27℃继续培养30-96小时左右，发酵时并补加50％的甘油作为碳源，甘油补加速率与溶氧串联，保持发酵的溶氧为60％；利用浓氨水来调节ph为6.0左右，发酵所得到的上清液中含有大量的真菌免疫调节蛋白。

23、进一步，步骤2)具体为先用ypg培养基培养至od600为5左右作为一级种子菌，将一级种子菌按1：2～7的比例接种到1/3无机盐培养基中培养至od600为30左右作为二级种子，将二级种子以1：8～12的比例接种含有无机盐培养基的发酵罐中。

24、进一步，还包括蛋白纯化步骤：相对饱和度为80％的硫铵溶液沉淀目标蛋白，经ph8.5的10mm tris-hcl缓冲液溶解沉淀并透析去除盐离子，先用ph 8.5的10mm tris-hcl缓冲液平衡deae层析柱，再将经离心和过滤处理的蛋白液过柱，用含20mm nacl的ph 8.0的10mm tris-hcl缓冲液漂洗柱子，然后用含200mm nacl的ph 7.2的20mm pbs将目标蛋白洗脱下来即可得到高纯度目标蛋白。

25、3、上述任一项所述制备方法得到的蛋白在制备降血糖制品中的应用。

26、4、上述任一项所述制备方法得到的蛋白在制备抗肿瘤或提高机体免疫力制品中的应用。

27、本发明提供的技术方案具有以下优点：本发明提供一种高表达真菌免疫调节蛋白的重组菌，具体为包含有如序列表中seq id no.1、seq id no.9、seq id no.10、seq idno.11所示的核苷酸序列。还提供一种真菌免疫调节蛋白制备方法，可实现目标蛋白在毕赤酵母宿主菌中的高水平重组分泌表达，最高可达15.4g/l。本发明制备方法制备的蛋白不会有甲醇的残留，可以简单通过硫铵沉淀和deae离子交换柱进行纯化。在生物药物产品开发上更具优势。另外，与诱导型转化子相比，组成型转化子生长培养的周期要明显短于甲醇诱导，可以大大节约生产发酵的时间。该真菌免疫调节蛋白经口服对机体的免疫能力有显著的增强作用，在提高免疫力、降血糖和抗肿瘤等方面具有良好的应用前景。

28、本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。