一种检测甘蔗花叶病毒的胶体金免疫试纸条及专用抗体的制作方法

本发明涉及植物病毒检测，具体涉及一种检测甘蔗花叶病毒的胶体金免疫试纸条及专用抗体。

背景技术：

1、玉米(zea mays l.)是世界第一大粮食作物，在保障全球粮食安全中举足轻重。玉米矮花叶病(maize dwarf mosaic disease)是一种世界性玉米病害，严重危害非洲、美洲、亚洲和欧洲的玉米安全生产(fuchs et al.,1990；kannan et al.,2018)。在中国，由矮花叶病造成的玉米产量损失在20％～80％，严重地块则高达90％甚至100％。该病毒病的发生具有典型的爆发性、迁移性和间歇性特点：最早于20世纪60至70年代在我国华北地区大流行，随后在不同玉米主产区流行发生；进入80年代，由于抗病玉米品种的推广和栽培措施的改进，有效防治了该病害；在20世纪90年代，由于感病品种的大面积种植，该病害又出现回升且逐年加重(张成和等，1995；李新海和张世煌，2000)；进入21世纪后玉米矮花叶病在我国间歇性发生(范武刚等，2011；gao et al.,2011；yan et al.,2016)。

2、在大部分玉米产区，导致玉米矮花叶病的主要病原是甘蔗花叶病毒scmv。近年来，尽管在玉米中已经鉴定了两个抗scmv的基因(leng et al.,2017；liu et al.,2017)，但在田间已经出现了一些能够突破玉米抗性的scmv强毒株系(gao et al.,2011；yan et al.,2016)；同时还发现了一些自然重组的scmv株系(moradi et al.,2016)；而且scmv在田间的传播方式多样，主要经蚜虫以非持久方式传播，也可经机械摩擦和种子传播；此外，scmv还侵染高粱、甘蔗等作物以及多种杂草，一方面直接影响作物产量和品质，另一方面受scmv侵染的杂草可作为初侵染源，进而引发scmv在田间的流行；以上这些因素都使得对scmv的防控更为困难和艰巨。

3、“苗期检测+病株拔除”是防控作物病毒病的最有效手段之一，特别在一些高附加值的玉米制种田中确保scmv的清零具有重要经济价值。当前针对scmv的检测主要包括分子生物学和血清学检测方法；其中，基于rt-pcr的分子生物学检测手段可准确检测出样品中低丰度的scmv，灵敏度高，特异性强；血清学检测最常用的是酶联免疫吸附试验(elisa)，尽管检测灵敏度低于rt-pcr，但这种检测方法的特异性强和检测通量高；然而，以上2种检测方式需要精密仪器和专业的操作人员，只适用于低通量样品的检测，而并不适合于田间大量样品的检测，无法在田间地头实现对疑似病毒侵染样品的检测。而胶体金免疫试纸条操作简单，可在5～20分钟内通过肉眼观察判断检测结果，非常适用于在田间地头对病毒的检测。由于缺少配对识别scmv的特异性单克隆抗体，目前还未见有检测scmv胶体金试纸条的报道。

4、因此，开发和建立一种稳定地利用胶体金免疫试纸条检测scmv的方法对玉米矮花叶病的防控具有重要的应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种检测甘蔗花叶病毒的胶体金免疫试纸条及专用抗体。

2、第一方面，本发明提供了杂交瘤细胞株组，其包括分泌甘蔗花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株sc-bj-4和分泌甘蔗花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株sc-bj-6；

3、所述分泌甘蔗花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株sc-bj-4，其保藏编号为cctccno：c 2023360；

4、所述分泌甘蔗花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株sc-bj-6，其保藏编号为cctccno：c 2023361。

5、第二方面，本发明提供了单克隆抗体组，其包括单克隆抗体sc-bj-4和单克隆抗体sc-bj-6；

6、所述单克隆抗体sc-bj-4由保藏编号为cctcc no：c 2023360的杂交瘤细胞株分泌产生；

7、所述单克隆抗体sc-bj-6由保藏编号为cctcc no：c 2023361的杂交瘤细胞株分泌产生。

8、第三方面，本发明提供了第一方面所述的杂交瘤细胞株组或第二方面所述的单克隆抗体组在识别或辅助识别或检测或辅助检测甘蔗花叶病毒或其分离物或其粒子中的应用。

9、第四方面，本发明提供了第一方面所述的杂交瘤细胞株组或第二方面所述单克隆抗体组在制备识别或辅助识别或检测或辅助检测甘蔗花叶病毒或其分离物或其粒子产品中的应用。

10、上文所述应用中，所述产品为胶体金免疫试纸条。

11、第五方面，本发明提供了一种识别或辅助识别或检测或辅助检测甘蔗花叶病毒的产品，其包括第二方面所述单克隆抗体sc-bj-4和所述单克隆抗体sc-bj-6。

12、上文所述产品为胶体金免疫试纸条。

13、上文所述胶体金免疫试纸条包括固定在底板上的样品垫、免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸；

14、所述免疫胶体金垫是结合有胶体金颗粒标记第二方面中所述单克隆抗体sc-bj-6的金标垫；

15、进一步地，所述免疫胶体金垫为将终浓度1.5mg/ml的含有胶体金颗粒标记单克隆抗体sc-bj-6的免疫胶体金溶液喷于金标垫，涂覆量2.5μl/cm，制备免疫胶体金垫。

16、所述硝酸纤维素膜设有检测线和质控线，所述检测线包被第二方面中所述单克隆抗体sc-bj-4。

17、所述质控线包被羊抗鼠igg抗体。

18、进一步地，所述单克隆抗体sc-bj-4和所述羊抗鼠igg抗体的包被浓度均为1mg/ml；

19、进一步地，所述检测线与质控线之间相距6-6.5mm。

20、在本发明的一种实施方案中，给出了检测甘蔗花叶病毒的胶体金免疫试纸条的制备过程，包括以下步骤：

21、(1)调节胶体金溶液的ph为7.0-7.8，向胶体金溶液中加入单克隆抗体sc-bj-6，使单克隆抗体sc-bj-6的终浓度为20-30μg/ml；混合均匀，室温反应35～45min，加入bsa溶液终止反应，静置20～40min，低速离心弃去凝聚的金胶粒沉淀，然后高速离心，弃去上清，沉淀物用金标液复溶，制成含有胶体金颗粒标记单克隆抗体sc-bj-6的免疫胶体金溶液；

22、(2)将步骤(1)制备的免疫胶体金溶液涂在金标垫上，得到免疫胶体金垫；

23、(3)将单克隆抗体sc-bj-4和羊抗鼠igg抗体分别喷涂于硝酸纤维素膜上，形成含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；

24、(4)在底板上依次搭接固定样品垫、免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，即制备得到胶体金免疫试纸条。

25、第六方面，本发明提供了第一方面中的所述分泌甘蔗花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株sc-bj-4或分泌甘蔗花叶病毒单克隆抗体的杂交瘤细胞株sc-bj-6。

26、第七方面，本发明提供了第二方面中的所述单克隆抗体sc-bj-4或所述单克隆抗体sc-bj-6。

27、本发明还提供上述胶体金免疫试纸条的制备方法，包括以下步骤：

28、(1)调节胶体金溶液的ph为7.0-7.8，向胶体金溶液中加入单克隆抗体sc-bj-6，使单克隆抗体sc-bj-6的终浓度为20～30μg/ml；混合均匀，室温反应35～45min，加入bsa溶液终止反应，静置20～40min，低速离心弃去凝聚的金胶粒沉淀，然后高速离心，弃去上清，沉淀物用金标液复溶，制成含有胶体金颗粒标记单克隆抗体sc-bj-6的免疫胶体金溶液；

29、(2)将步骤(1)制备的免疫胶体金溶液涂在金标垫上，得到免疫胶体金垫；

30、(3)将单克隆抗体sc-bj-4和羊抗鼠igg抗体分别喷涂于硝酸纤维素膜上，形成含有检测线和质控线的硝酸纤维素膜；

31、(4)在底板上依次搭接固定样品垫、免疫胶体金垫、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，即制备得到胶体金免疫试纸条。

32、优选的，步骤(1)中，所述胶体金溶液按照如下方法制备：

33、将1％氯金酸溶液加热至沸腾，迅速加入新制备的1％枸橼酸钠溶液，继续搅拌加热至溶液出现红色，继续煮沸出现透明的橙红色，保持煮沸7～10min，自然冷却至室温。

34、优选的，步骤(1)中，所述胶体金溶液中的胶体金的粒径为30～40nm。

35、优选的，步骤(1)中，所述免疫胶体金溶液中胶体金颗粒标记单克隆抗体sc-bj-4的浓度为2mg/ml。

36、优选的，步骤(1)中，所述bsa溶液的质量浓度为10％。

37、优选的，步骤(2)中，免疫胶体金溶液涂在金标垫上的涂覆量为2.5μl/cm2。

38、优选的，步骤(3)中，单克隆抗体sc-bj-6和羊抗鼠igg抗体均稀释至1mg/ml，用量均为0.7μl/cm；然后点射于硝酸纤维素膜上，分别形成检测线和质控线。

39、本发明的有益效果：

40、(1)本发明首次制备了能够特异性识别甘蔗花叶病毒的单克隆抗体sc-bj-4和单克隆抗体sc-bj-6。将单克隆抗体sc-bj-4和sc-bj-6组合使用能有效区分玉米褪绿斑驳病毒和黄瓜花叶病毒(cmv-zmbj分离物，侵染玉米)，不存在交叉反应。

41、(2)本发明的scmv胶体金免疫试纸条可准确、特异、灵敏地检测田间玉米叶片中的scmv。该试纸条在5～20min内可通过肉眼观察检测结果，非常适合田间大批量样品检测，在实际生产中具有重要应用价值，对scmv的诊断、监测及预警提供物质支持。

42、保藏说明

43、培养物名称：杂交瘤细胞株(hybridoma cell line)

44、细胞株编号：sc-bj-4

45、保藏机构：中国典型培养物保藏中心

46、保藏机构简称：cctcc

47、地址：中国武汉，武汉大学

48、保藏日期：2023年12月12日

49、保藏中心登记入册编号：cctcc no：c2023360

50、保藏说明

51、培养物名称：杂交瘤细胞株(hybridoma cell line)

52、细胞株编号：sc-bj-6

53、保藏机构：中国典型培养物保藏中心

54、保藏机构简称：cctcc

55、地址：中国武汉，武汉大学

56、保藏日期：2023年12月12日

57、保藏中心登记入册编号：cctcc no：c2023361