一种基于双识别引发滚环扩增检测外泌体的生物传感器

本发明属于生物传感器，涉及一种基于双识别引发滚环扩增检测外泌体的新型生物传感器。

背景技术：

1、外泌体是含有特定蛋白、核酸以及脂质的一类细胞外囊泡。研究发现，癌细胞产生的外泌体作为一种细胞间通讯方式，能够促进细胞生长，增加肿瘤的侵袭性和转移性。近年来，液体活检作为一种非侵袭性的筛查方法广受关注，外泌体作为其潜在的生物标志物，在癌症诊断和治疗方面具有较强的临床应用前景。由于外泌体表面蛋白并不是完全异质性的，导致不同来源外泌体之间具有相同的蛋白标志物，因此外泌体的准确检测仍然是一个巨大的挑战。此外，分析外泌体表面蛋白种类与表达水平，发掘潜在肿瘤标志物的蛋白组合，有助于癌症的早期诊断和预后治疗。

技术实现思路

1、本发明提供了一种特异性和灵敏度高、成本低、检测速度快的基于扩增技术检测外泌体的生物传感器。

2、本发明的另一目的是提供一种上述生物传感器在检测外泌体中的应用与方法。

3、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案。

4、一种基于双识别引发滚环扩增检测外泌体的生物传感器，包括：

5、探针al1，探针al2，pl链，t4 dna连接酶、phi29 dna聚合酶、脱氧单核苷酸（dntp）混合液、tht（四氢噻吩）；

6、所述识别探针al1和al2以及pl的核苷酸序列如seq id no:1-3所示。

7、上述生物传感器的制备方法，包括以下步骤：

8、（1）将al1、al2、pl混合后在含有atp和mg2+的缓冲液中混合并加入待测物孵育，加入t4 dna连接酶反应获得s1溶液；

9、（2）将s1溶液中加入phi29 dna聚合酶、dntp和tht在缓冲液中混合反应获得检测液。

10、本发明还提供了一种包含上述传感器的试剂盒。

11、本发明的检测原理如图1所示，其中各核酸元件的序列如下（相同下划线的互补）：

12、探针al1：

13、5’-cacc ccac ctcg ctcc cgtg acac taat gctatttt tttt tttt tttc acatgacccata ccga-3’；

14、探针al2：

15、5’-cata agac tggt catg tgtt tttt tttt tttt tacg ggcc acat caac tcat tgat agac aatg cgtc cact gccc gt-3’；

16、pl：

17、5’-agtcttatgcagcatggaggtttttcagcatggaggtcggtatg-3’；

18、其中，al1由cd63 apt和pl链3’端互补的序列组成；

19、al2由pdl1 apt和与pl链5’端互补的序列组成；

20、pl与al1和al2均部分互补；

21、本发明以外泌体膜上cd63和pdl1两种蛋白为检测对象。cd63是一种经典的四跨膜家族标志物，在外泌体表面高表达。pdl1（程序性死亡蛋白受体1）是一种介导免疫抑制的蛋白，在肿瘤免疫逃逸中起作用，研究表明pdl1在a375分泌的外泌体表面高表达。本发明设计了两条带有蛋白适配体的识别探针al1、al2，能够特异性结合外泌体表面蛋白，从而形成完整的连接探针。连接探针能够与pl链互补，在连接酶存在时形成完整的滚环模板。在上述复合物中加入dna聚合酶和dntp，启动rca反应（滚环扩增反应），产生长且具有富g序列的dna单链，形成富g-四联体的dna链。随后荧光物质tht可嵌入g-四联体，引发信号放大。在没有目标物或者仅存在单一阳性蛋白外泌体时，无法形成完整的连接探针，导致不能合成滚环模板，后续rca也无法进行，游离的tht信号太弱无法通过荧光检测到，外泌体也无法通过常规的流式细胞仪检测。

22、本发明具有以下优点：

23、本发明的传感器用于检测外泌体时，可以通过荧光进行检测，且荧光信号与外泌体膜蛋白数量成正比；由于rca反应是在外泌体膜外侧进行，可认为是单颗粒尺寸的增大，可达到流式检测的尺寸。另外，该传感器采用双识别，可在一定程度上降低了游离蛋白或者仅含单一阳性蛋白的外泌体引起的假阳性。利用其检测的方法成功实现了复杂样品中目标物的检测。与需要复杂步骤或价格昂贵的传统方法不同，所提出的方法具有操作简便、成本低且反应速度快等的优点，同时不需要耗费大量时间制备样品。更为重要的是，理论上通过改变适配体序列便可特异性靶向不同蛋白质，有望适应于临床样品的高通量检测。因此，该策略有望成为早期癌症检测的有力工具。

技术特征：

1.一种基于双识别引发滚环扩增检测外泌体的生物传感器，其特征在于，包括：

2.根据权利要求1所述的生物传感器，其特征在于，外泌体膜表面包含cd63和pdl1。

3.一种如权利要求1或2所述的生物传感器的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

4.一种包含如权利要求1或2所述的生物传感器的试剂盒。

技术总结本发明属于生物传感器技术领域，提供了一种外泌体生物传感器，包括：包括识别探针AL1和AL2以及PL、T4 DNA连接酶、Phi29 DNA聚合酶、脱氧核苷酸（dNTP）混合液、THT；所述识别探针AL1和AL2以及PL的核苷酸序列如SEQ ID NO:1‑3所示；该方法不需要复杂步骤或价格高昂的仪器设备，具有操作简便、低成本检测以及高特异性等的优势，因此可适应高通量检测，未来有望满足临床大量样品的检测要求。技术研发人员：王玉,朱芮,黄加栋,刘素,朱镜儒,庞庆澳,李博文,杨美丽,孙唯卿,肖宜静受保护的技术使用者：济南大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18