一种玻尿酸的分离纯化方法与流程

本发明涉及玻尿酸生产，特别涉及一种玻尿酸的分离纯化方法。

背景技术：

1、玻尿酸(透明质酸)是一种由葡萄糖醛酸和乙酰氨基葡萄糖重复键结所构成的线性高分子黏多醣(glycosaminoglycan)，其分子量最高可达1.3×107道尔顿。玻尿酸是动物体内常见的物质，广泛分布于结缔组织、表皮、神经组织当中，也是细胞间质的主要成份，已知其对细胞增生与移动都有相当大的贡献。

2、玻尿酸具有高度的亲水性，尤其在水溶液中因为玻尿酸具有高分子量及大量的带电基团的特性，更能展现其高度黏着性及吸水性。正因为此特性，玻尿酸可维持皮肤的弹性及张力，所以玻尿酸早已广泛应用于各式各样的保养品及化妆品中，此外玻尿酸的应用还包含膝关节注射剂、手术防沾黏、伤口癒合、胚胎培养、组织再生等医疗领域。

3、传统的玻尿酸是由动物组织萃取，如鸡冠、猪皮、牛眼玻璃体等，但是由于动物来源的玻尿酸品质不易控管，因此近年来发展出细菌发酵制法。发酵法更适合大量生产，也比较容易控管产出品质，其优点还包括可以降低生产成本、提高单位生产量、避免病毒颗粒或动物蛋白所造成的过敏反应。目前最常使用的发酵菌株为链球菌。

4、先前许多分离发酵液中玻尿酸的方法大都使用多种且大量有机溶剂及清洁剂，这些方法不但昂贵而且对生态而言也是一种破坏。如专利us4517295、us4780414、us5563051及us2006012987中所揭露的纯化玻尿酸的方法就使用了大量的有机溶剂以沉淀杂质。

5、除了上述大量使用有机溶剂的纯化方法外，也有部分研究使用过滤及调整ph值等方式改善方法，如专利us6489467揭露一种通过调整ph值及透析的方法纯化玻尿酸，但是该专利没有揭示连续改变ph值的萃取方法；cn200610090586揭露一种使用磁场强化膜过滤发酵液的方法，该专利所使用的过滤膜并不适合大量生产玻尿酸。

6、因此，有必要提供一种纯化玻尿酸的方法以满足市场的需要。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种玻尿酸的分离纯化方法，从而得到高纯度的玻尿酸样品。

2、本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

3、一种玻尿酸的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

4、s1，取玻尿酸发酵液，在快速搅拌状态下缓慢加入乙醇，加入完毕后，继续搅拌后再静止，后续进行离心得到初步沉淀；

5、s2，取离心后的初步沉淀加入乙醇后进行多次洗涤；

6、s3，取洗涤后的沉淀加入去离子水后进行溶解，再加入珍珠岩助滤剂，搅拌均匀，通过板框过滤除去沉淀杂质,过滤完毕后，通过乙酸调整ph值，使用雾状乙醇喷入滤液中，不断搅拌，使玻尿酸在搅拌中聚集成颗粒沉淀,收集颗粒沉淀后溶解于去离子水中，搅拌至完全溶解；

7、s4，通过凝胶过滤层析柱对溶解后的玻尿酸进行分离纯化，层析柱为workbeads40/1000，收集洗脱液；

8、s5，取收集后的洗脱液加入过氧化氢进行脱色，直到溶液变为澄清，再将溶液用乙醇进行沉淀，再通过离心获得沉淀，最后干燥后得到分离纯化后的玻尿酸。

9、优选的，所述乙醇均为95％乙醇。

10、优选的，所述s1中乙醇添加量为玻尿酸发酵液的60％，加入完毕后快速搅拌10～20min，静置1h后置于1000～1500r/min离心机中离心5～10min。

11、优选的，所述s3中珍珠岩助滤剂与洗涤后的沉淀质量比为1:100，去离子水相对洗涤后的沉淀的加入量为每毫克100～150ml。

12、优选的，所述s3中滤布型号750b，过滤压力低于0.4mpa。

13、优选的，所述s3中通过乙酸调整ph值至7.0，雾状乙醇的喷入体积为去离子水体积的1.5～2倍。

14、优选的，所述s4中洗脱液为0.2mol/l氯化钠溶液，流速为1ml/min，柱温为25℃。

15、优选的，所述过氧化氢体积分数为30～35％，加入量为洗脱液体积的1/10，脱色过程中控制ph为7，温度为55～60℃。

16、综上所述，本发明具有以下有益效果：本发明制备得到的样品中玻尿酸含量超过92％，蛋白质含量小于0.025％，透光率高于99.7％，产品指标达到食品级和化妆品级玻尿酸质量标准要求。

技术特征：

1.一种玻尿酸的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种玻尿酸的分离纯化方法，其特征在于：所述乙醇均为95%乙醇。

3. 根据权利要求1所述的一种玻尿酸的分离纯化方法，其特征在于：所述s1中乙醇添加量为玻尿酸发酵液的60%，加入完毕后快速搅拌10~20min，静置1 h后置于1000~1500r／min离心机中离心5~10min。

4.根据权利要求1所述的一种玻尿酸的分离纯化方法，其特征在于：所述s3中珍珠岩助滤剂与洗涤后的沉淀质量比为1:100，去离子水相对洗涤后的沉淀的加入量为每毫克100~150ml。

5.根据权利要求1所述的一种玻尿酸的分离纯化方法，其特征在于：所述s3中滤布型号750b，过滤压力低于0.4mpa。

6.根据权利要求1所述的一种玻尿酸的分离纯化方法，其特征在于：所述s3中通过乙酸调整ph值至7.0，雾状乙醇的喷入体积为去离子水体积的1.5~2倍。

7.根据权利要求1所述的一种玻尿酸的分离纯化方法，其特征在于：所述s4中洗脱液为0.2mol/l氯化钠溶液，流速为1ml/min，柱温为25℃。

8.根据权利要求1所述的一种玻尿酸的分离纯化方法，其特征在于：所述过氧化氢体积分数为30~35%，加入量为洗脱液体积的1/10，脱色过程中控制ph为7，温度为55~60℃。

技术总结本发明公开了一种玻尿酸的分离纯化方法，包括如下步骤：S1，取玻尿酸发酵液，在快速搅拌状态下缓慢加入乙醇，后续进行离心得到初步沉淀；S2，取离心后的初步沉淀加入乙醇后进行多次洗涤；S3，取洗涤后的沉淀加入去离子水后进行溶解，再加入珍珠岩助滤剂，通过板框过滤除去沉淀杂质，使用雾状乙醇喷入滤液中，使玻尿酸在搅拌中聚集成颗粒沉淀,收集颗粒沉淀后溶解于去离子水中；S4，通过凝胶过滤层析柱对溶解后的玻尿酸进行分离纯化，收集洗脱液；S5，取收集后的洗脱液加入过氧化氢进行脱色，再将溶液用乙醇进行沉淀，再通过离心获得沉淀，最后干燥。本发明的优点在于玻尿酸产品指标达到食品级和化妆品级玻尿酸质量标准要求。技术研发人员：宋金裕,倪燕彬,张荣华受保护的技术使用者：南通沧海生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18