一种提取粉尘螨总RNA的方法

本发明涉及粉尘螨rna分离纯化，具体为一种提取粉尘螨总rna的方法。

背景技术：

1、粉尘螨隶属于蜱螨亚纲，真螨总目，无气门亚目、麦食螨科，广泛分布于居室的阴暗角落，以人类或动物身上掉下来的皮屑为食。粉尘螨的尸体、分泌物和排泄物都是过敏源，可诱发过敏性皮炎、哮喘病、支气管炎、异位性皮炎、过敏性鼻炎等疾病，严重危害人体健康。流行病学调查指出，世界上约0.65～1.30亿人患有和尘螨相关的过敏性疾病。粉尘螨是迄今为止发现的最强过敏原之一，因此探寻粉尘螨过敏原的研究意义重大。其中要进行逆转录、蛋白质印迹、斑点印迹、rt-pcr，以及利用高通量测序技术探寻粉尘螨被杀螨剂杀灭的作用位点等，都需使用到粉尘螨的rna。实验的成败也主要取决于粉尘螨总rna的质量。

2、目前提取rna的方法有trizol法、传统sds法、ctab法等。由于粉尘螨个体仅有0.1-0.4mm，且提取rna需要较高样本量，因此已发表的大量涉及到粉尘螨rna提取的文章都使用了价格昂贵的试剂盒进行提取。粉尘螨rna提取难题主要表现为粉尘螨rna易受rnase的降解、rna质量受材料样本限制。粉尘螨含有大量色素等，因此分离高质量rna难度较大。

3、目前常用的rna提取方法中，trizol是一种新型总rna抽提试剂，采用变性剂即内含异硫氰酸胍、酚和β-巯基乙醇等变性物质，能迅速破碎细胞，抑制细胞释放出的核酸酶。主要成分异硫氰酸胍是一类强力的蛋白质变性剂，可溶解蛋白质，并使蛋白质二级结构消失，细胞结构降解，核蛋白迅速与核酸分离，保护rna完整性。在多重试剂的相互辅助下，trizol法提取rna效果良好，不易有dna污染等问题，但是trizol试剂价格昂贵，一瓶100mltrizol(invitrogen)试剂单价在2000-5000rmb间，仅可使用80-100次。

4、传统sds法采用十二烷基硫酸钠(sds)在高温条件下能裂解细胞，使染色体离析、蛋白变性，同时sds与蛋白质和多糖结合成复合物，释放出核酸这种特性来提取rna；加入的水饱和酚也可使蛋白质变性、沉淀，继而从核酸提取液中将蛋白质分离除去；醋酸钠溶液的加入创造了酸性的水相环境，使rna进入水相，另其可与有机相中的蛋白质与dna分离。接着加入氯仿，加速有机相和水相的分层，rna进入水相中；接着利用异丙醇将rna沉淀出来。此法利用酚、氯仿抽提，成本低，但运用此法提取的粉尘螨rna存在明显蛋白污染及色素沉着，以及存在蛋白污染，不适于下游分子生物学研究。

5、对ctab法来说，由于以ctab为变性剂，同时加入pvp和β一巯基乙醇共同作用变性蛋白、抑制rnase的活性，使用无水乙醇或异丙醇沉淀杂蛋白和总核酸等，然后再选择性地分离出rna，但是实际提取总rna不完整，效果不理想。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种提取粉尘螨总rna的方法，本发明所用试剂实验室普遍常见，操作简单，成本低。且提取的rna质量合格，提取效果稳定，能够解决提取粉尘螨总rna不完整、dna、蛋白污染严重、存在色素影响现象等问题，可用于大批量粉尘螨样本的rna提取及长时间的使用，经济高效。

2、本发明具体技术方案如下：

3、一种提取粉尘螨总rna的方法，包括以下步骤：

4、1)粉尘螨液氮处理，然后加入孵育后的核酸萃取液a以及冰浴处理的核酸萃取液b，冰上研磨混匀，室温静置，得到粉尘螨组织匀浆液；

5、2)向粉尘螨组织匀浆液中加入核酸萃取液c与核酸萃取液d，摇晃混匀，室温孵育，离心，提取上层清液1；

6、3)再向上层清液1中加入核酸萃取液e，摇晃混匀，室温孵育，离心，提取上层清液2；

7、4)再向上层清液2中加入核酸萃取液f，摇晃混匀，室温孵育，离心，提取上层清液3；

8、5)再向上层清液3中加入核酸萃取液g，颠倒混匀，室温孵育，离心，去液留沉淀物；

9、6)向步骤5)所得沉淀物中加入核酸萃取液h，摇晃混匀，离心，去液得沉淀物；置于室温通风处干燥，加入在depc水中，吹打混匀，在零下-80℃下保存。

10、步骤1)中，粉尘螨液氮处理，处理时间为5-20min。

11、步骤1)中，所述孵育后的核酸萃取液a是指：核酸萃取液a孵育温度为65℃，时长10min，孵育后再使用。核酸萃取液a进行了65℃温育10min,可以使核酸裂解液效果最大化。温度为65℃时，试剂的自身效果最好以及试剂间的融合、互相作用、与螨的裂解作用最好。

12、步骤1)中，孵育后的核酸萃取液a是分多次加入，具体为：首次加入孵育后的核酸萃取液a总用量的25％的孵育后的核酸萃取液a与全部核酸萃取液b，冰上研磨混匀后，剩余的孵育后的核酸萃取液a分1-2次加入剩余a即可。因为离心管容量有限，一次性加入会在研磨时溢出造成样品流失，而且多次加入可以冲刷留在管壁上的螨碎片。

13、首次加入孵育后的核酸萃取液a总用量的25％的孵育后的核酸萃取液a与全部核酸萃取液b，使其与螨充分结合，在研磨看到均为细小颗粒时即可分1-2次加入剩余a混匀后即可进行室温。加入过早会研磨不均，过晚会导致rna降解。

14、步骤1)中，所述冰浴处理的核酸萃取液b，冰浴处理是指放在冰里面20-30min，使其温度明显低于室温即可。

15、步骤1)中，所述核酸萃取液a包括质量浓度10％的十二烷基硫酸钠(sds)、水饱和酚和depc，体积比为十二烷基硫酸钠：水饱和酚：depc＝1:5:2。

16、步骤1)中，所述核酸萃取液b为β-巯基乙醇；加入少量β-巯基乙醇，主要破坏核糖核酸酶蛋白质中的二硫键，β-巯基乙醇与sds联用更好的抑制rnase活性，在制备组织匀浆时，可使得内源的rna酶失活。并且进行冰浴处理，使其更好地降低rna的降解速率。

17、步骤1)中，所述孵育后的核酸萃取液a和冰浴处理的核酸萃取液b体积比为160:1；

18、步骤1)中，孵育后的核酸萃取液a和粉尘螨用量比0.5-1：1μl/个；

19、步骤1)中，所述冰上研磨是指：先在温度为(-196)℃-(-210)℃条件下处理2-3s，然后使用电动研磨器进行冰上研磨，时间为3-5min。

20、本发明中使用了液氮以及电动研磨器。由于粉尘螨体积小，液氮处理可使其聚集于管底，方便核酸萃取液裂解细胞。并且研磨在提取小型节肢动物时十分重要，电动研磨器的使用可以使组织研磨更加充分，节省时间，避免rna不必要的降解。

21、步骤1)中，所述室温静置，时间为2min；

22、步骤2)中，所述核酸萃取液c溶液为醋酸钠缓冲液，浓度为2-3mol/l，ph为3.8。

23、步骤2)中，所述核酸萃取液d为蛋白酶k水溶液，浓度为0.05-1mg/ml；

24、步骤2)中，所述核酸提取液c与核酸提取液d的体积比为10：1；

25、所述核酸提取液c和孵育后的核酸萃取液a的体积比为1:4；

26、步骤2)中，所述离心是指在4℃，12000rpm/min，离心15min；

27、本发明在匀浆充分混匀后加入浓度为3mol/l，ph值为3.8的醋酸钠缓冲液，便于naac缓冲液更好的匀浆混合；同时醋酸钠溶液创造酸性的水相环境，低ph值的酚将使rna进入水相，这样使其与仍留在有机相中的蛋白质和dna分离。本发明加入少量蛋白酶k。由于粉尘螨属于节肢动物，有外壳，蛋白酶k的使用可以使其外壳软化，更好的裂解。并且sds不会使之失活。可辅助sds，水饱和酚等发挥作用。

28、步骤3)中，所述核酸萃取液e包含如下原料：水饱和酚、氯仿和异戊醇，体积比为125:24:1。

29、步骤3)中，所述核酸萃取液e和上清液1的体积比为1:1；

30、步骤3)中，所述离心是指在4℃，13000rpm/min，离心10min；

31、步骤4)中，所述核酸萃取液f包含氯仿和异戊醇，氯仿与异戊醇的体积为24：1。

32、步骤4)中，上清液2和核酸萃取液f等体积；

33、步骤4)中，所述离心是指在4℃，13000rpm/min，离心10min；

34、本发明中进行了两次抽提(核酸萃取液e和f处理)，第一次加入了水饱和酚(核酸萃取液e)，水饱和酚在rna提取中用于分离rna和其他细胞组分。其中的氯仿可与dna和rna中的蛋白质结合，从而将它们从酚相分离出来。二次是因为酚对蛋白质的变性作用远大于氯仿，但是酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；另外酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后仍有大量的酚溶解到水相中，其会抑制后续的酶促反应(比如限制性酶切反应)，因此再用氯仿抽提一次，将酚完全除去。本发明核酸萃取液f利用氯仿结合异戊醇再次对总rna进行纯化，因异戊醇可是离心后上下层的界面更加清晰，方便水相的回收。并且减少粉尘螨色素对其rna质量的影响。两次抽提就是相互协同，将rna萃取到最大程度。

35、步骤5)中，所述核酸萃取液g为乙二醇丁醚；

36、步骤5)中，所述核酸萃取液g和上清液3体积比为1:1；

37、步骤5)中，所述离心是指在4℃，12000rpm/min，离心10min；

38、本发明利用乙二醇丁醚对rna进行沉淀，沉淀效果好，沉淀时间较短，且rna质量稳定。

39、步骤6)所述核酸萃取液h为体积分数75％乙醇溶液；

40、步骤6)具体为：用体积浓度为75％的乙醇洗涤沉淀，在4℃，12000rpm/min，离心5min，去液留物，并重复洗涤操作两次；本发明利用75％的乙醇进行两次洗涤，有效去除盐离子。

41、步骤6)中通风处干燥1-2min。本发明中rna的晾干缩短至1-2min，由于粉尘螨rna量少易分解，通风处1-2min内即可，且晾置时间过久不易溶解，影响后续实验的进行。

42、以上方法中，所述摇晃混匀的时长为12-18s；所述颠倒摇晃混匀的次数为8-12次。

43、步骤2)-步骤5)中所述室温孵育，时间为2-10min。

44、本发明中，本发明提供的提取试剂成分简单，价格低廉，提取效率高，rna产物稳定。且未使用异硫氰酸胍，其具有强毒性，与酸接触可释放极高毒性气体，且吸入、摄入、皮肤接触均可造成损伤。本发明使用的提取试剂实验室常见，操作步骤简单，成本低，能够高效的提取粉尘螨总rna，提取的rna质量合格，提取效果稳定，且能够解决提取粉尘螨总rna不完整、dna、蛋白污染严重、存在色素影响现象等问题，可用于大批量粉尘螨样本的rna提取及长时间的使用。