一种耐热耐碱的阿魏酸酯酶及其制备方法和应用

本发明涉及生物，具体是一种耐热耐碱的阿魏酸酯酶及其制备方法和应用。

背景技术：

1、阿魏酸酯酶又称为肉桂酰酯酶或肉桂酸酯酶，是羧酸水解酶的一个亚类，从属于碳水化合物酯酶亚家族，属于胞外酶。阿魏酸酯酶能有效水解半纤维素与木质素之间的阿魏酰键，从而促进其它酶或化学试剂对木质素的高效脱除；还能够催化水解植物细胞壁中阿魏酸、对香豆酸等酚酸与木质素、纤维素、半纤维素等多糖之间的酯键，释放出阿魏酸、对香豆酸等酚酸的水解酶；阿魏酸酯酶可降解植物细胞壁多糖，破坏植物细胞壁致密的交联网状结构；阿魏酸酯酶在加速木质纤维素降解的同时还能够释放出阿魏酸、p-香豆酸等抗氧化物质，在食品、造纸、医药、饲料等行业具有很高的应用价值和广阔的市场前景。

2、由于阿魏酸酯酶在木质纤维素降解中的独特功能，自该酶被发现后，一直是近些年研究的热点。目前阿魏酸酯酶已从多种生物中分离纯化得到，根据来源可以分为微生物阿魏酸酯酶和植物阿魏酸酯酶。黑曲霉(aspergillus niger)是目前研究最多的真菌，先后已经有六种阿魏酸酯酶从中分离纯化出来，分别为fae-i、fae-ii、anfaea、anfaeb、fae-1和fae-2，它们的理化性质和底物特异性均不相同，其中fae-i、fae-ii、anfaea和anfaeb都是酸性阿魏酸酯酶，在酸性条件下较为稳定，而fae-1和fae-2则在碱性条件下较为稳定。瘤胃真菌新美鞭菌属(neocallimastix)mc-2菌株可以产生两种阿魏酸酯酶，分子量大小分别为69kda和24kda，两种酶的最适ph值都接近中性，最适温度均在40℃左右。

3、从1991年至今，已有60多种阿魏酸酯酶已经被分离纯化，其中主要为微生物阿魏酸酯酶，植物中只有大麦芽和龙爪稷中的阿魏酸酯酶被分离纯化。这些阿魏酸酯酶的理化性质差异很大，主要表现在分子量大小、最适ph值和温度、等电点、底物特异性等方面，不同理化性质的阿魏酸酯酶对应不同的实际需求。目前已经有近20种不同来源的阿魏酸酯酶基因被克隆和测序，其中多个已经在原核和真核表达系统实现了异源或同源表达。来源于黑曲霉的阿魏酸酯酶faea在大肠杆菌中的表达量仅为在黑曲霉中表达量的1/10，相比而言，毕氏酵母(pichia pastoris)是较理想的真菌阿魏酸酯酶的表达体系，以芽殖酵母的α因子为分泌信号，并利用醇氧化酶i(aoxi)基因的启动子来驱动基因表达，在毕氏酵母中已经实现了多个真菌阿魏酸酯酶基因的异源表达。

4、虽然现有阿魏酸酯酶的理化性质差异较大，但大部分的阿魏酸酯酶的最适温度或最适ph处于较低范围，在面对某些高温合并高碱环境时，仍存在一定的应用限制。专利公开号为“cn110184256a”(申请号201910384386.3)的发明专利申请中公开了一种耐热耐碱阿魏酸酯酶，以卷曲乳杆菌的dna为模板，制备含有阿魏酸酯酶基因的重组大肠杆菌，将重组大肠杆菌经iptg诱导发酵，去除菌体，制备得到阿魏酸酯酶，制备的阿魏酸酯酶的最适反应条件为65℃和ph 7.0，具有良好的耐热性和耐碱性特点。但是，在面对更高温度和更高的ph环境时，该酶的应用依然受限。

5、另外，目前现有的阿魏酸酯酶生产菌株的阿魏酸酯酶产量普遍偏低，从而导致该酶的生产成本居高不下，也进一步限制了其应用，难以商品化。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供了一种耐热耐碱的阿魏酸酯酶及其制备方法和应用，该酶在70℃和ph 7.5条件下表现出最大的酶活性，在20～80℃范围内均能保持41.11％以上的酶活性，在ph为5.0～9.0条件下均能保持55.76％以上的酶活性，且在宿主菌中能够高效表达，产量大幅度提高。

2、本发明技术方案如下：

3、一种耐热耐碱的阿魏酸酯酶，其氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、所述阿魏酸酯酶的编码基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示。

5、所述阿魏酸酯酶的制备方法，包括如下步骤：

6、(1)以特异腐质霉的cdna作为模板进行pcr扩增，得阿魏酸酯酶的编码基因；

7、(2)将阿魏酸酯酶的编码基因导入毕赤酵母中，得重组毕赤酵母；

8、(3)将重组毕赤酵母进行诱导发酵，去除菌体，得阿魏酸酯酶。

9、优选的，步骤(1)中所述pcr扩增的步骤为：以特异腐质霉的cdna为模板，pcr扩增阿魏酸酯酶基因片段，pcr扩增所使用的引物分别为：

10、上游引物f：gaattcgcgtcgctgcagcaggtctgg；

11、下游引物r：cctaggttagataagcctgaagaacct。

12、进一步优选的，步骤(1)中所述pcr扩增的条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃保温10min。

13、优选的，步骤(2)中所述将阿魏酸酯酶的编码基因导入毕赤酵母中的方法为：将所得阿魏酸酯酶基因片段经限制性内切酶ecori和avrii双酶切，与相同酶切线性化的表达载体ppic9k连接，得重组表达载体ppic9k-hifaeb；将重组表达载体ppic9k-hifaeb转化至宿主菌毕赤酵母中，得重组毕赤酵母。

14、优选的，步骤(3)中所述诱导发酵的方法为：将重组毕赤酵母接种至bmgy液体培养基，30℃、230～250rpm振荡培养，得种子液；将种子液以0.5％～1％的接种量接种到bmgy液体培养基中，30℃、230～250r/min培养；离心，收集菌体，用bmmy液体培养基重悬菌体，30℃、230～250rpm振荡培养，每12h添加0.5～1％(v/v)的甲醇溶液，诱导发酵4天，得发酵液；将发酵液离心，收集发酵上清液，得阿魏酸酯酶酶液。

15、所得阿魏酸酯酶的最适反应温度为70℃，在75℃时的相对酶活性为其最大酶活性的89.64％，在20～80℃范围内的相对酶活性均保持在其最大酶活性的41.11％以上，在90℃时还能够保留其原始活性的13.76％；该酶的最适反应ph为7.5，在ph为5.0～9.0范围内的相对酶活性均保持在其最大酶活性的55.76％以上，在ph为10时的相对酶活性为其最大酶活性的26.27％。该酶表现出良好的热稳定性和广泛的ph稳定性。

16、一种重组载体，包含上述阿魏酸酯酶编码基因。

17、一种重组菌，包含上述重组载体。

18、优选的，所述重组菌的宿主菌为毕赤酵母。

19、所述阿魏酸酯酶在温度为20～80℃、ph为5.0～9.0条件下协同木聚糖酶漂白纸浆中的应用。

20、优选的，所述温度为65～80℃，所述ph为7.0～9.0。

21、本发明的有益效果：

22、(1)本发明所制备得到的阿魏酸酯酶的最适反应温度为70℃，在20～80℃范围内的相对酶活性均保持在其最大酶活性的41.11％以上；最适反应ph为7.5，在ph为5.0～9.0范围内的相对酶活性均保持在其最大酶活性的55.76％以上，表现出良好的热稳定性和广泛的ph稳定性。

23、(2)本发明所制备得到的阿魏酸酯酶能够在毕赤酵母中高效表达，可以大幅阿魏酸酯酶的产量。