一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用

本发明属于属于生物医药，尤其涉及一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用。

背景技术：

1、本部分的陈述仅仅是提供了与本发明相关的背景技术信息，不必然构成在先技术。

2、胶原蛋白是哺乳动物中含量最多，分布最广的功能性蛋白质，约占蛋白质总量的30％。同时，胶原蛋白还是细胞外基质的关键结构成分，存在于所有组织和器官，包括皮肤、骨骼、肌腱、韧带、软骨等。经过数十年的研究，目前已分离鉴定出29种胶原蛋白。尽管这些胶原蛋白的生物功能和物理特性差异巨大，但均具有特征性的三重螺旋结构。胶原蛋白特有的三螺旋结构及氨基酸组成赋予胶原蛋白多种独特的生物学功能，如生物相容性、低免疫原性、生物可降解性以及凝血性等。因此，胶原蛋白成为制备创面敷料、化妆品、组织工程、医疗器械等应用领域的重要材料。

3、传统胶原蛋白的生产方法是利用酸、碱、酶解法来处理动物来源的组织进行提取。利用这些方法提取的胶原蛋白往往失去原本的生理活性，无法发挥正常的生物学功能。此外，还存在着病原体或朊病毒污染的风险，这在一定程度上限制基于天然胶原蛋白材料的进一步发展。

4、随着现代生物技术的发展，通过基因工程手段获得重组人源胶原蛋白成为一种可行的方法。在重组人源胶原蛋白序列的基础进行合理优化，这使得该蛋白相较天然胶原蛋白更具应用价值和发展前景。例如cn116284456a公开了一种重组人源胶原蛋白及其编码基因、应用，该制备方法获得的胶原蛋白表达量高，且可以用于哺乳动物细胞的三维培养，还可用作培养中促进细胞粘附的包衣剂等。然而，现有重组人源胶原蛋白的制备方法，往往比较复杂，步骤繁琐，而且制备得到的重组人源胶原蛋白的稳定性差，容易析出。因此如何开发一种制备工艺简单，纯度高，且利于活性保持的重组人源胶原蛋白的制备方法成为本领域目前迫切需要解决的问题。

5、此外，目前，实现外源表达人源胶原蛋白通常借助人源细胞或酵母细胞，还未能实现借助细菌如大肠杆菌实现人源胶原蛋白高效生成。如，cn117603365a中公开利用基因重组的方式，将i型、iii型、vi型进行串联后转化到毕赤酵母中实现发酵生产的方法。cn117467024a中利用人胚胎肾细胞expi293f实现外源表达重组胶原蛋白。但是以上方法受到动物源组织的限制，且真核细胞容易遭受细菌的侵染，造成生产困难。

技术实现思路

1、为克服上述现有技术的不足，本发明提供了一种重组人源胶原蛋白及其制备方法和应用。本发明中，通过对现有的天然人体胶原蛋白氨基酸序列进行合理编排，设计出与人体来源结构相同的重组人源胶原蛋白。该重组人源胶原蛋白制备方法简单，规避了生产过程中动物源限制及病原体污染的风险，纯化效果好，易于规模化生产。

2、为实现上述目的，本发明的一个或多个实施例提供了如下技术方案：

3、本发明的第一方面，提供一种重组人源胶原蛋白，所述氨基酸序列如seq id no.1所示。

4、seq id no.1:

5、mgsshhhhhhssgggsggsenlyfqgeqgpqglagqrgivglpgqrge

6、rgfpglpgkdgqdglpgkdgergfpgergeqgpagergekgeqgpqge

7、agaqgpagergapgfrgpagpngipgekgpagergapgekgetgprgdr

8、gdkgekgeagpqgiagqrgvvglpgqrgergfpglpgkdgeagpqgpa

9、gqdgkdgergeqgptgpagergfpgergprgergeagkdgqdgkp

10、本发明的第二方面，提供一种重组载体，所述重组载体编码上述重组人源胶原蛋白。

11、在本发明的具体实施方式中，所述重组载体包含seq id no.2所示序列。seq idno.2可实现胶原蛋白表达。

12、seq id no.2:

13、atgggtagcagccatcaccatcaccatcacagcagcggtggtggtagcggtggtagcgaaaacctgtattttcagggcgaacagggtccgcagggtttagcaggtcaacgtggtattgttggtctgccgggtcagcgtggtgaacgtggttttccgggtctgccgggtaaagatggtcaggatggtctgccgggtaaagatggtgaacgtggttttccgggtgaacgtggtgaacagggtccggcaggtgaacgtggtgaaaaaggtgaacagggtccgcagggtgaagcaggtgcacaaggtcctgcaggtgaacgtggtgcacctggttttcgtggtccggcaggtcctaatggtattccgggtgaaaaaggtccggcaggtgaacgtggtgcaccgggtgaaaaaggtgaaaccggtccgcgtggtgatcgtggtgataaaggtgaaaaaggtgaagcaggtccgcagggtattgcaggtcagcgtggtgttgttggtctgccgggtcagcgtggtgaacgtggttttccgggtctgccgggtaaagatggtgaagcaggtccgcagggtccggcaggtcaagatggtaaagatggtgaacgtggtgaacagggtccgaccggtccggcaggtgaacgtggttttcctggtgaacgtggtccgcgtggtgaacgtggtgaagcaggtaaagatggtcaggatggtaaaccg

14、在本发明的具体实施方式中，所述重组载体还包括pet-28a，其序列可直接通过snapgene网站获取，具体为：pet-28a(+)sequence and map(snapgene.com)。

15、本发明的第三方面，提供一种宿主，所述宿主中包含第一方面所述重组人源胶原蛋白或第二方面所述的重组载体。

16、在本发明的具体实施方式中，所述宿主包括真核生物和原核生物；

17、所述真核生物包括动物细胞和酵母细胞；

18、其中，动物细胞包括常用的细胞系中国仓鼠卵巢细胞cho、非洲绿猴肾成纤维细胞cos、幼年叙利亚地鼠肾细胞bhk、sp2/0、小鼠胚胎成纤维细胞nih/3t3；

19、酵母细胞包括酿酒酵母和甲醇营养型酵母。进一步的，甲醇酵母包括汉森酵母属(hansenula)，毕赤酵母属(pichia)，球拟酵母属(torulopsis)。

20、优选的，所述宿主为原核生物；

21、更优选的，所述宿主为大肠杆菌。

22、在本发明的具体实施方式中，所述大肠杆菌包括dh5α、bl21(de3)、bl21、rosetta(de3)、rosetta2(de3)、origamib(de3)或jm109(de3)。

23、本发明的第四方面，提供第一方面所述重组人源胶原蛋白、第二方面所述的重组载体或第三方面所述宿主在提高人源胶原蛋白产量中的应用。

24、本发明的第五方面，提供提供第一方面所述重组人源胶原蛋白、第二方面所述的重组载体或第三方面所述宿主在提高人源胶原蛋白稳定性中的应用。

25、本发明的第六方面，提供一种重组胶原蛋白生物合成方法，包括以下步骤：

26、1)将seq id no.2所示核酸序列构建到蛋白质表达载体上获得重组载体；

27、2)将重组载体转化到大肠杆菌bl21(de3)菌株中，37℃震荡培养至od600达到0.4～0.6后加入iptg，37℃培养5h～6h；

28、3)提取步骤2)中菌体的粗蛋白溶液，加入到已装镍的亲和层析镍柱中；

29、4)采用buffer a、buffer b依次洗脱，并在tev buffer中透析；

30、5)将步骤5)中所得透析液再次加入到已装镍的亲和层析镍柱中，收集流穿液；并透析至蒸馏水中，透析时间为6h每次共3次；

31、6)将步骤5)所得溶液冷冻风干后获得纯化后的重组人源胶原蛋白；

32、其中，所述iptg的添加量为3-6mm；

33、所述buffer a为50mm tris，250mm nacl，30mm咪唑，ph＝8；

34、所述buffer b为50mm tris，250mm nacl，400mm咪唑,ph＝8；

35、所述tev buffer为50mm tris，ph 8.0，0.1mm edta，1mm dtt。

36、以上一个或多个技术方案存在以下有益效果：

37、本发明，基于原有的胶原蛋白序列的基础上，选择胶原蛋白核心功能序列，并且对其等电点进行合理分布等，达到重组人源胶原蛋白理性排列的目的。该重组人源胶原蛋白与天然的胶原蛋白一样，同样具备胶原蛋白特有的三重螺旋结构。

38、本发明中，重组人源胶原蛋白能够利用大肠杆菌进行大规模生产，摆脱了动物源组织的限制及病原体污染的风险。

39、本发明提供的重组人源胶原蛋白的制备方法，是基于镍柱亲和层析的基础上，选择合适的洗脱液对重组人源胶原蛋白进行纯化，纯化过程步骤简单，易于得到高纯度的产品。

40、此外，在后续的制备过程中还特异性的除去非天然存在的特异性组氨酸序列等，摆脱了潜在性的未知风险，制备出与天然人体胶原蛋白具有同样三重螺旋结构的重组人源胶原蛋白。该重组人源胶原蛋白有望在未来完全替代天然的胶原蛋白，在生物医疗、化妆美容等行业发挥出不可替代的作用。

41、本发明附加方面的优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。