香豆素转运蛋白及其用途的制作方法

背景技术：

1、植物病原生物(特别是真菌)可以导致作物产量严重下降，并且最坏的情况下会导致饥荒。尤其是单一栽培，非常容易受到流行病的病害爆发的影响。迄今为止，主要通过杀有害生物剂来防治病原生物。目前，人类也有可能直接改变植物或植物病原体的遗传特征。这为植物在感染后产生天然存在的杀真菌剂或抗真菌化合物提供了机会。可替代地，可以合成那些抗真菌化合物并将其应用于植物。

2、产量受到多种因素的影响，例如植物器官的数量和大小、植物结构(例如分枝数量)、饱满种子或谷物的数量、植物活力、生长速度、根发育、水和营养物质的利用、以及尤其是非生物和生物胁迫的严重程度。

3、过去，人们一直在努力创造对生物胁迫(例如由真菌病原体引起的)具有抗性的植物。如本文所用，术语“抗性”是指不存在或减少由植物病原体引起的植物中的一种或多种病害症状。抗性通常描述植物防止或至少减少有害病原体侵袭和定植的能力。在天然存在的抗性中可以辨别出不同的机制，植物通过这些机制抵御植物病原生物的定植(schopfer和brennicke(1999)pflanzenphysiologie[植物生理学],springer verlag[施普林格出版社]，柏林-海德堡(berlin-heidelberg)，德国)。然而，在自然界中，由于病原体的快速进化、巨大的遗传变异性和高子代数量，从而迅速进化出新毒性种类，抗性往往很快被克服。这适用于所有病原生物，包括真菌(neu等人(2003)american cytopathol.society[美国细胞病理学会],mpmi[分子植物-微生物相互作用杂志]16第7期:626-633)。

4、真菌遍布全世界。迄今为止，已知大约有100,000种真菌物种。其中，锈菌(rustfungi)具有重要的科学和经济意义。它们可以具有复杂的生命周期，具有多达五个不同的孢子阶段(性孢子、春孢子、夏孢子、冬孢子和担孢子)。发展出了特别的感染结构来穿透植物。活体营养型植物病原真菌依赖于活植物细胞的代谢来获取营养。活体营养型真菌的实例包括许多锈菌、白粉病真菌和卵菌病原体，例如疫霉属(phytophthora)或霜霉属(peronospora)中的那些。坏死营养型植物病原真菌的营养依赖于死亡的植物细胞，例如镰刀菌属(fusarium)、丝核菌属(rhizoctonia)或球腔菌属(mycospaerella)中的物种。在这方面，大豆锈病处于中间位置。它直接穿透表皮，并且被穿透的细胞很快坏死。然而，在穿透后，真菌转变为专性活体营养型生活方式。基本上遵循这样的感染策略的活体营养型真菌病原体的亚组是半坏死营养型的。

5、引起大豆锈病的真菌豆薯层锈菌(phakopsora pachyrhizi)直接穿透植物表皮。在通过表皮细胞生长后，真菌到达叶肉的细胞间隙，并且真菌开始通过叶扩散。为了获得营养，真菌穿透叶肉细胞并通过使叶肉细胞的质膜内陷在叶肉细胞内形成吸器。豆薯层锈菌是特别令人不安的病原体，因为它表现出巨大的变异性，从而在几年内并且有时甚至在一个生长季节内克服了新颖的植物抗性机制和新颖的杀真菌剂活性。对于巴西的大豆栽培来说尤其如此。

6、尽管病害抗性具有科学意义，但其只有在病害胁迫条件下提高作物产量或改善作物质量(与易感品种相比)时才具有经济价值。

7、过去，人们尝试在植物中产生或积累一类称为香豆素的抗真菌内源次生代谢物，特别是莨菪亭、东莨菪苷、秦皮乙素、异莨菪亭和滨蒿内酯。用于在植物中合成香豆素的基因、材料和方法描述于wo 2016124515和wo 2020120753中，两者均作为参考文献并入本文。虽然例如莨菪亭的表达在减少真菌感染方面非常有效，但也观察到莨菪亭生物合成基因的组成型强表达可导致总体植物健康和产量降低，特别是在大豆中。

8、因此，本发明的目的是提供改善植物病害抗性(特别是在作物中)的材料和方法，并且优选地还减少获得所述改善的病原体抗性的手段可能带来的对总体植物健康和/或产量的负面影响。特别地，本发明的优选的目的是提供使得植物材料对真菌病原体具有遗传性改善的抗性且最大限度地减少总体植物健康的降低的材料和方法，其中抗性优选地针对锈菌，并且最优选地针对层锈菌属(phakopsora)、镰刀菌属、核盘菌属(sclerotinia)、链格孢属(alternaria)、棒孢霉属(corynespora)、尾孢菌属(cercospora)或壳针孢属(septoria)的真菌。

技术实现思路

1、在第一方面，本发明提供了包含用于表达异源香豆素转运蛋白(pct)基因的核酸的植物细胞。

2、在另外的方面，本发明提供了包含植物细胞的植物或植物部分，其中该植物细胞包含用于表达异源香豆素转运蛋白(pct)基因的核酸。

3、在另外的方面，本发明提供了通过对本发明的植物进行育种获得的植物子代，其中该子代包含异源pct基因。

4、在另一方面，本发明提供了本发明的植物或植物部分的非繁殖植物部分或材料，优选地发酵产物、油、粗粉、压滤饼、油渣、谷壳、稻草或堆肥。

5、在另外的方面，本发明提供了本发明的植物、植物部分或植物细胞的产物，其中该产物通过以下可获得或通过以下获得：

6、i)收集所述植物、植物部分或植物细胞，优选地可收获的植物部分并且最优选地植物种子的材料，以及

7、ii)破坏收集的材料，优选地以获得发酵产物、油、粗粉、压滤饼、油渣、谷壳、稻草或堆肥。

8、本发明还提供了一种用于提供或增加植物表面香豆素积累能力的方法，该方法包括使野生型基因突变，使得在相应编码的pct蛋白中，

9、-野生型基因序列与氨基酸序列seq id no.2之间的差异数量减少，并且/或者

10、-将根据seq id no.2进行编号的以下突变中的一个或多个或全部引入该野生型基因序列中：x8k、x10a、x31t、x32s、x39m、x40d、x67d、x75f、x76g、x78t、x80p、x81s、x84v、x87d、x88n、x91v、x92e、x95k、x96h、x106d、x111k、x118r、x120l、x125i、x127l、x138t、x142d、x156f、x157h、x160i、x164l、x165l、x170l、x171l、x172p、x174s、x178i、x182d、x212a、x218e、x221s、x224k、x233h、x241s、x308a、x310v、x332q、x356k、x381q、x382f、x383l、x387e、x416i、x419q、x424n、x427e、x456e、x460m、x464e、x472k、x473e、x483v、x485r、x489n、x492a、x493t、x497k、x498s、x508e、x512l、x521c、x522t、x523d、x537i、x541f、x544s、x545v、x553v、x562r、x563d、x564l、x567g、x569l、x571m、x574l、x577g、x578v、x579t、x581i、x625s、x626f、x629a、x633t、x647t、x655i、x658l、x669f、x685s、x688l、x689l、x690l、x692f、x701r、x702d、x714s、x720a、x725a、x731g、x732h、x735r、x736t、x737p、x738l、x739n、x740g、x741s、x742t、x746f、x747s、x748i、x752g、x755a、x756e、x772l、x773v、x783a、x786n、x789g、x791a、x794n、x796s、x799d、x800e、x802d、x803a、x804a、x805v、x808t、x809s、x810r、x811n、x812n、x814g、x816q、x834d、x836k、x847d、x856l、x900d、x947d、x950e、x951h、x952k、x957v、x958d、x969i、x980n、x1073e、x1080a、x1102t、x1108a、x1115e、x1116i、x1128a、x1131a、x1135v、x1144f、x1158v、x1200k、x1203q、x1207m、x1215a、x1233d、x1258v、x1262i、x1271v、x1287a、x1296q、x1297l、x1298c、x1303m、x1312a、x1317a、x1318n、x1321a、x1330i、x1339i、x1340p、x1354g、x1372f、x1374d、x1375v、x1378n、x1384e、x1385y、x1387d、x1390f、x1400v、x1402g、x1404h、x1405v、x1407l、x1408v、x1409l、x1413f、x1417y。

11、在另外的方面，本发明提供了一种自动化植物选择方法，该方法包括以下步骤：

12、i)对于多个种子中的每个种子，获得包含代表所述种子的组织体的遗传物质的样品，

13、ii)确定该遗传物质中根据任何本发明的pct基因的存在，以及任选地用于产生一种或多种香豆素的代谢途径的一种或多种基因的存在，

14、iii)选择步骤ii)中的确定给出阳性结果的那些种子。

15、本发明还提供了异源香豆素转运蛋白用于以下中的任一项的用途：

16、-提供或增加植物表面上香豆素的积累，

17、-减少、减弱或抑制植物表面上植物病原微生物的生长，以及

18、-提供或增加植物对植物病原微生物和/或寄生植物感染的抗性。