一种基于CRISPR-Cas12a的胡萝卜软腐果胶杆菌可视化快速检测方法

本发明属于微生物检测领域，具体涉及一种基于crispr-cas12a的胡萝卜软腐果胶杆菌可视化快速检测方法。

背景技术：

1、胡萝卜软腐果胶杆菌(pectobacterium carotovorumsubsp.carotovorum,pcc)是一种重要的植物病原菌，能够在彩色马蹄莲、白菜、胡萝卜、番茄等寄主上引起严重的细菌性软腐病。，给农业生产造成巨大的经济损失。软腐病往往是一旦发生，难以控制，导致农作物大面积死亡。所以，软腐病的防治，重点在防。预防软腐病，其病原菌的早期预警尤为关键。传统的检测方法有pcr法，elisa法等，这些方法操作程序复杂繁琐、检测成本高、耗时、费力、专业性强，需要在专门的实验室内借助大型仪器完成，无法满足植物病原菌早期预警的现实需求。因此，现实农业生产迫切需要开发一种快速，低成本、灵敏度高，且能够在田间地头现场检测的可视化检测方法，这对于软腐病早期预警，避免造成农作物大面积死亡尤为重要。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题是如何简单快速鉴定胡萝卜软腐果胶杆菌或植物样本中是否存在胡萝卜软腐果胶杆菌。

2、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于鉴定或辅助鉴定胡萝卜软腐果胶杆菌的组合物，由名称为pcc-f的单链dna、名称为pcc-r的单链dna、特异于待检测生物的crrna、crrna缓冲液、lbacas12a蛋白、cas12a反应缓冲液和荧光报告探针组成。

3、所述pcc-f为核苷酸序列是序列表中seq id no.1的dna；

4、所述pcc-r为核苷酸序列是序列表中seq id no.2的dna；

5、所述crrna为核苷酸序列是序列表中seq id no.3的rna；

6、所述荧光报告探针为核苷酸序列是5’-fam/ttttattt/bhq1-3’。

7、上述组合物中，所述组合物还包括进行核酸扩增的试剂。

8、上述组合物中，所述核酸扩增为逆转录重组酶聚合酶扩增技术(简称rpa/raa等温扩增)。

9、本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定胡萝卜软腐果胶杆菌的试剂盒，含有权利要求1所述组合物与n；所述n为rehydration buffer(2x)、starter(10x)。

10、所述cas12蛋白为lbcas12a。

11、所述lbcas12a与所述crrna的摩尔比例为1:1。

12、所述lbcas12a与所述crrna的终浓度均为60nm。

13、所述荧光报告探针的终浓度为120nm。

14、所述试剂盒为等温扩增试剂盒。

15、前文所述组合物的制备方法，包括将前文所述pcc-f、所述pcc-r、所述特异于待检测生物的crrna、所述lbacas12a蛋白、所述荧光报告探针、所述crrna缓冲液和所述cas12a反应缓冲液分别单独包装的步骤。

16、前文所述试剂盒的制备方法，包括将前文所述pcc-f、所述pcc-r、所述特异于待检测生物的crrna、所述lbacas12a蛋白、所述荧光报告探针、所述crrna缓冲液和所述cas12a反应缓冲液分别单独包装的步骤。

17、本发明还提供了前文所述组合物在如下任一中的应用：

18、a1)制备用于鉴定或鉴别胡萝卜软腐果胶杆菌的产品；

19、a2)鉴定或鉴别胡萝卜软腐果胶杆菌；

20、a3)制备用于检测待测样品中是否含有胡萝卜软腐果胶杆菌的产品；

21、a4)检测待测样品中是否含有胡萝卜软腐果胶杆菌。

22、本发明还提供了前文所述试剂盒在如下任一中的应用：

23、a1)制备用于鉴定或鉴别胡萝卜软腐果胶杆菌的产品；

24、a2)鉴定或鉴别胡萝卜软腐果胶杆菌；

25、a3)制备用于检测待测样品中是否含有胡萝卜软腐果胶杆菌的产品；

26、a4)检测待测样品中是否含有胡萝卜软腐果胶杆菌。

27、本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定待测样本是否感染胡萝卜软腐果胶杆菌的方法，包括如下步骤：

28、提取待测样本的核酸，以所述核酸为模板，采用前文所述的试剂盒进行等温扩增得到扩增产物，随后采用前文所述的crrna、cas12蛋白和荧光报告探针进行显色反应，根据显色反应的荧光确定待测样本是否含有胡萝卜软腐果胶杆菌。

29、具体判定方式如下：

30、若所述显色反应的产物在蓝光下发出绿色荧光，则所述待测病原样本中至少含有胡萝卜软腐果胶杆菌；若所述显色反应的产物在蓝光下不发出绿色荧光，则所述待测病原样本中不为胡萝卜软腐果胶杆菌。

31、本发明还提供了检测胡萝卜软腐果胶杆菌的方法，包括利用前文所述的组合物检测待测样品是否含有胡萝卜软腐果胶杆菌的核酸。

32、本发明提供了一种基于crispr-cas12a系统胡萝卜软腐果胶杆菌的可视化快速检测方法，所述的方法在低成本的仪器下，可短时间内即裸眼判断待测样品中是否含有胡萝卜软腐果胶杆菌。相对比较传统的pcr检测方法，灵敏度有大幅度的提升，且不需要使用复杂精密的仪器和装备精良的实验室，大大缩短了检测的时间，具有操作简单，结果判断简单的优点，只需要一个恒温装置及简易的荧光监测装置即可快速的获得结果。本发明具有低成本、高灵敏度、耗时短、高效，适于现场检测的特点。

技术特征：

1.鉴定或辅助鉴定胡萝卜软腐果胶杆菌的组合物，由名称为pcc-f的单链dna、名称为pcc-r的单链dna、特异于待检测生物的crrna、crrna缓冲液、lbacas12a蛋白、cas12a反应缓冲液和荧光报告探针组成；

2.鉴定或辅助鉴定胡萝卜软腐果胶杆菌的试剂盒，含有权利要求1所述组合物与n；所述n为rehydration buffer 2×、starter 10×。

3.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒为等温扩增试剂盒。

4.权利要求1所述组合物的制备方法，包括将权利要求1中所述pcc-f、所述pcc-r、所述特异于待检测生物的crrna、所述lbacas12a蛋白、所述荧光报告探针、所述crrna缓冲液和所述cas12a反应缓冲液分别单独包装的步骤。

5.权利要求2所述试剂盒的制备方法，包括将权利要求1中所述pcc-f、所述pcc-r、所述特异于待检测生物的crrna、所述lbacas12a蛋白、所述荧光报告探针、所述crrna缓冲液和所述cas12a反应缓冲液分别单独包装的步骤。

6.权利要求1所述组合物在如下任一中的应用：

7.权利要求2或3所述试剂盒在如下任一中的应用：

8.一种鉴定或辅助鉴定待测样本是否感染胡萝卜软腐果胶杆菌的方法，包括如下步骤：

9.检测胡萝卜软腐果胶杆菌的方法，包括利用权利要求1所述的组合物检测待测样品是否含有胡萝卜软腐果胶杆菌的核酸。

技术总结本发明公开了一种基于CRISPR‑Cas12a的胡萝卜软腐果胶杆菌可视化快速检测方法。本发明属于微生物检测领域，涉及一种基于CRISPR‑Cas12a的胡萝卜软腐果胶杆菌可视化快速检测方法。本发明提供鉴定或辅助鉴定胡萝卜软腐果胶杆菌的组合物，由Pcc‑F的单链DNA(核苷酸序列是SEQ ID No.1)、Pcc‑R的单链DNA(核苷酸序列是SEQ ID No.2)、特异于待检测生物的CrRNA(核苷酸序列是SEQ ID No.3)、CrRNA缓冲液、LbaCas12a蛋白、Cas12a反应缓冲液和荧光报告探针组成，本发明的检测方法具有灵敏度高、特异性强、便携、快速等特点，能够满足现场检测需求。技术研发人员：陈得峰,秦娇娇,卫尊征,钟雄辉,袁梦,张月阳受保护的技术使用者：北京市农林科学院技术研发日：技术公布日：2024/6/18