一种用于半糯型水稻品质改良的KASP分子标记引物组及其应用

本发明涉及一种用于半糯型水稻品质改良的kasp分子标记引物组及其应用，属于生物育种。

背景技术：

1、中国是世界水稻生产和消费大国，60％以上人口以稻米为主食。经济的快速发展和人民生活水平的提高，带来了饮食生活的变化，人们的消费观也正从“吃的饱”向“吃的好”改变，具有优良食味品质的稻米越来越受到消费市场的重视。因此，提升稻米品质已是一项十分迫切的任务。稻米品质通常包括：碾米品质、外观品质、营养品质、蒸煮品质、食味品质和卫生品质6类。其中稻米外观品质是决定稻米商品价值的重要因素，也是消费者关注的首要性状。一般来说，稻谷的外观品质越好，其市场价格越高，消费者的购买意愿也越强。

2、长江中下游地区一直是我国南方粳稻主产区，温光资源丰富，产量水平高。近年，随着长江中下游粳稻育种工作的进展，选育出了一批以南粳46、南粳9108为代表的优质、高产品种，获得了广大消费者的青睐，并多次在国家和江苏省优质食味粳稻评比中获得一等奖、优质食味粳米等荣誉称号。然而，目前长江中下游稻区提高稻米食味品质的一个重要途径是通过降低直链淀粉含量选育半糯型粳稻来实现，但通过该途径培育的优质软米外观品质普遍较差，多表现为云雾状、暗胚乳表型。在半糯型粳稻选育过程中，对半糯型粳稻外观品质的表型鉴定需要等籽粒成熟后，对其透明度、垩白等表型进行观察鉴定，无法实现对后代群体的精准预测。已有研究报道，直链淀粉含量的高低决定着稻米的透明度。在相同含水量的情况下，直链淀粉含量越高，透明度越好。目前报道的与淀粉合成相关的基因有20多个，分别参与直链淀粉和支链淀粉的合成。为了开展半糯型粳稻外观品质改良的分子标记辅助育种工作，前期通过对我国栽培粳稻直链淀粉含量的全基因组关联分析，发现beiib、ssiv-1、ssi、ssiia和pul存在与直链淀粉含量显著相关性的功能等位位点。

3、竞争性等位基因特异性pcr(kompetitive allele specific pcr，kasp)是一种一步法的基因型鉴定技术，通过荧光信号判断目标位点的基因型，不需要经过繁琐的凝胶电泳分析。由于kasp标记具有省时省力，费用低廉等特点，逐步成为分子标记辅助育种中常用的标记类型。因此，开发一种用于半糯型水稻品质改良的kasp分子标记具有重要的现实意义。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题在于提供一种用于半糯型水稻品质改良的kasp分子标记引物组。本发明所要解决的另一技术问题在于提供一种用于半糯型水稻品质改良的kasp分子标记引物组的应用，用于提高半糯型粳稻直链淀粉含量，从而提升外观品质尤其是透明度，提高育种效率。

2、为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下：

3、用于半糯型水稻品质改良的kasp分子标记的引物组，所述引物序列如下所示：

4、ssi-f1:gaaggtgaccaagttcatgctgccttgaacaaaaattttgcaaacgct，

5、ssi-f2:gaaggtcggagtcaacggattccttgaacaaaaattttgcaaacgcc，

6、ssi-r:gttctccgccaaagcatggaatctt；

7、ssiia-f1:gaaggtgaccaagttcatgctaagagaactcctcctcctcgg，

8、ssiia-f2:gaaggtcggagtcaacggattaagagaactcctcctcctcgc，

9、ssiia-r:cgcgcggatgatggggagaa；

10、ssiv-1-f1:gaaggtgaccaagttcatgctggaaagtggatgcgacggatga，

11、ssiv-1-f2:gaaggtcggagtcaacggattgaaagtggatgcgacggatgc，

12、ssiv-1-r:cccccattgttacaccgttcaacaa；

13、beiib-f1:gaaggtgaccaagttcatgctgtggcatgctagagtttgacg，

14、beiib-f2:gaaggtcggagtcaacggattcgtggcatgctagagtttgaca，

15、beiib-r:gctcatatttgtgcaacccccagaa；

16、sbe4-f1:gaaggtgaccaagttcatgctgcatcgaacaattctgcttccag，

17、sbe4-f2:gaaggtcggagtcaacggattatgcatcgaacaattctgcttccat，

18、sbe4-r:aggggacagagggagtaagttcttt。

19、用于半糯型水稻品质改良的kasp分子标记的引物组的开发方法，步骤包括：

20、1)分别对高直链淀粉含量供体亲本“泗稻301”与低直链淀粉含量轮回亲本“南粳9108”进行目标基因测序；

21、2)比对供体亲本与受体亲本之间的beiib、ssiv-1、ssi、ssiia和pul基因序列，筛选得到snp突变位点；

22、3)根据筛选的snp突变位点进行kasp分子标记开发，最终开发得到用于半糯型水稻品质改良的kasp分子标记，合成用于半糯型水稻品质改良的kasp分子标记的引物组。

23、kasp分子标记的引物组在半糯型水稻外观品质改良中的应用，步骤包括：

24、1)对高直链淀粉含量供体亲本“泗稻301”与低直链淀粉含量轮回亲本“南粳9108”进行杂交和回交，获得分离群体；

25、2)使用kasp分子标记的引物组对分离群体进行kasp分子标记检测，聚合在接近x轴的显示蓝色的样本的基因型为连接fam荧光标签序列的beiib(c/c)、ssiv-1(t/t)、ssi(a/a)、ssiia(a/a)和pul(g/g)等位基因型，聚合在接近y轴上的显示红色的样本的基因型为连接hex荧光标签序列的beiib(t/t)、ssiv-1(c/c)、ssi(g/g)、ssiia(g/g)和pul(a/a)等位基因型，中间显示绿色的样本的基因型为beiib(c/t)、ssiv-1(t/c)、ssi(a/g)、ssiia(a/g)和pul(g/a)杂合型；

26、3)对检测结果进行分析，选择含有纯合目标基因型的株系进行品质检测，得到外观改良的粳稻新品系。

27、所述kasp分子标记检测的pcr反应体系为2×kasp master mix 5μl，kasp primermix 0.14μl，模板dna 1μl，ddh2o 3.86μl。

28、所述kasp分子标记检测的pcr反应程序为94℃预变性15min；94℃变性20s；61-55℃退火延伸60s，10个循环，每个循环降低0.6℃；94℃变性20s；55℃退火延伸60s，26个循环。

29、kasp分子标记的引物组在半糯型水稻外观品质改良中的应用，改良水稻外观品质为降低水稻稻米的透明度、垩白率、垩白度。

30、kasp分子标记的引物组在半糯型水稻食味品质改良中的应用。

31、kasp分子标记的引物组在半糯型水稻食味品质改良中的应用，改良水稻食味品质为使水稻稻米的直链淀粉含量显著增加、使水稻稻米的胶稠度显著增加、使水稻稻米的糊化温度显著降低。

32、本发明的有益效果：

33、1)本发明公开的用于半糯型水稻品质改良的kasp分子标记的引物组的开发方法，步骤包括：分别对高直链淀粉含量供体亲本“泗稻301”与低直链淀粉含量轮回亲本“南粳9108”进行目标基因测序；比对供体亲本与受体亲本之间的beiib、ssiv-1、ssi、ssiia和pul基因序列，筛选得到snp突变位点；根据筛选的snp突变位点进行kasp分子标记开发，最终开发得到用于半糯型水稻品质改良的kasp分子标记，合成用于半糯型水稻品质改良的kasp分子标记的引物组。

34、2)本发明最终分子标记辅助筛选得到了6株聚合不同基因的新株系(y16、y75、y115、y121、y143和y235)。与轮回亲本“南粳9108”相比，5个株系(y16、y75、y115、y143和y235)的稻米外观品质均大幅度提升，垩白率、垩白度和透明度均明显降低；株系之间的稻米外观品质也存在一定的差异，其中y235的垩白率、垩白度和透明度与供体亲本“泗稻301”接近。与轮回亲本“南粳9108”相比，5个株系(y16、y75、y115、y143和y235)的直链淀粉含量明显升高。与供体亲本“泗稻301”相比，胶稠度升高，糊化温度降低，蛋白质含量不变。

35、3)本发明根据颜色对目标基因beiib、ssiv-1、ssi、ssiia和pul开发的kasp分子标记进行分类。聚合在接近x轴的显示蓝色的样本的基因型为连接fam荧光标签序列的beiib(c/c)、ssiv-1(t/t)、ssi(a/a)、ssiia(a/a)和pul(g/g)等位基因型，聚合在接近y轴上的显示红色的样本的基因型为连接hex荧光标签序列的beiib(t/t)、ssiv-1(c/c)、ssi(g/g)、ssiia(g/g)和pul(a/a)等位基因型，中间显示绿色的样本的基因型为beiib(c/t)、ssiv-1(t/c)、ssi(a/g)、ssiia(a/g)和pul(g/a)杂合型。