活性肽、含有活性肽的组合物及其应用

本发明属于活性肽，更具体地说，涉及一种活性肽、含有活性肽的组合物及其应用。

背景技术：

1、炎症就是平时所说的“发炎”，是生物组织或细胞受到损伤或被外部感染源(如细菌、霉菌、病毒及各种过敏诱发物质)感染时，炎症反应与局部血管和体液中的各种炎症介质和免疫细胞有关而呈现的酶激活、炎性介质物质分泌、体液浸润、细胞移动、组织破坏等一联的复合性生理反应和红斑、水肿、发热及疼症等外部症状。具体地，若外部细菌侵入特定组织而增殖，则生物体内的白细胞认知其来对所增殖的外部细菌活跃地进行攻击，在上述过程中产生的白细胞的死骸堆积在由菌受到侵入的组织，同时由白细胞凋亡的侵入菌的细胞破坏胃向受到侵入的组织内溶解，从而形成脓肿。

2、在正常的情况下，炎症反应起到去除外部感染源，并且通过使损伤的组织再生，来起到生命体功能恢复作用，但是若未去除抗原或内部物质成为原因，来炎症反应过度或持续地发生，则作为威胁人体的生命的疾病呈现如急性炎症、类风湿关节炎等在关节内的疾病、以牛皮藓等的形态呈现的皮肤疾病及如支气管哮喘等的过敏性炎症疾病等，并且在输血、药物给药、器官移植等治疗过程中还成为障碍因素。其中脂多糖(lps)是革兰氏阴性细菌细胞壁的一部分，参与多种与炎症相关的疾病，包括败血性休克，血管炎症/动脉粥样硬化，神经退行性疾病，代谢综合征和炎症性肠病等。

3、目前临床广泛使用的抗炎药物比如非留体抗炎药在发挥治疗效果的同时，也会产生一些与用药目的无关的有害反应，即药物不良反应。目前，作为炎症治疗剂有利用肾上腺皮质激素的地塞米松、可的松等。虽然它们作为炎症治疗剂起到作用，但是毒性强，作为副作用还引起浮肿等症状。因此寻找具有抗炎效果且不良反应少的活性成分具有重要意义。

4、含肽类物质由于具有特异性高、毒副作用小、作用机制明确，不会伤及正常的细胞、组织和器官等优势，在癌症、心血管疾病、免疫相关疾病、代谢类疾病、传染性疾病的治疗中应用被逐步开发。近年来，越来越多具有生物活性的肽被应用于化妆品、食品、医疗、甚至免疫学等科学范畴。

技术实现思路

1、1.要解决的问题

2、本发明的目的之一，是为了提供一种活性肽，尤其是小分子肽，所述活性肽具有抗炎的作用；

3、同时，本发明还提供了能够编码所述活性肽的核苷酸、重组载体以及重组细胞；

4、本发明另外的目的，提供了所述活性肽在制备用于治疗或预防炎症性疾病的药物中的用途；

5、同时，本发明还提供了具有预防炎症或者消除炎症益处的饮食品的用途，以及具有预防炎症或者消除炎症益处的化妆品的用途；

6、本发明另外的目的，提供了含有所述活性肽的药物、饮食品，以及化妆品；

7、本发明另外的目的，提供了含有所述活性肽的用于治疗或预防炎症性疾病的药物；

8、同时，本发明还提供了具有预防炎症或者消除炎症益处的饮食品，以及具有预防炎症或者消除炎症益处的化妆品。

9、2.技术方案

10、本发明所采用的技术方案如下：

11、基于本发明的第一个目的，本发明第一方面提供了活性肽，所述活性肽包括：

12、(a)如seq id no.1所示的氨基酸序列；或者，

13、(b)如seq id no.2所示的氨基酸序列；或者，

14、(c)如seq id no.1和seq id no.2所示的氨基酸序列；或者，

15、(d)与所述(a)或(b)或(c)中定义的氨基酸序列具有至少70％的序列同源性的至少一个氨基酸序列；

16、其中，所述seq id no.1所示的氨基酸序列：ayswdnr(ala-tyr-ser-trp-asp-asn-arg)；

17、所述seq id no.2所示的氨基酸序列：agfagddapr(ala-gly-phe-ala-gly-asp-asp-ala-pro-arg)。

18、根据本发明第一方面的任一实施方案的活性肽，所述活性肽由：

19、(a)seq id no.1所示的氨基酸序列组成；或者，

20、(b)seq id no.2所示的氨基酸序列组成；或者，

21、(c)seq id no.1和seq id no.2所示的氨基酸序列组成；或者，

22、(d)与所述(a)或(b)或(c)中定义的氨基酸序列具有至少70％的序列同源性的至少一个氨基酸序列。

23、根据本发明第一方面的任一实施方案的活性肽，所述活性肽包括：

24、(a)与seq id no.1所示的氨基酸序列具有至少80％的序列同源性的氨基酸序列；或者，

25、(b)与seq id no.1所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同源性的氨基酸序列；或者，

26、(c)与seq id no.1所示的氨基酸序列具有至少95％的序列同源性的氨基酸序列；或者，

27、(d)与seq id no.2所示的氨基酸序列具有至少80％的序列同源性的氨基酸序列；或者，

28、(e)与seq id no.2所示的氨基酸序列具有至少90％的序列同源性的氨基酸序列；或者，

29、(f)与seq id no.2所示的氨基酸序列具有至少95％的序列同源性的氨基酸序列；或者，

30、(g)所述(a)～(f)中定义的氨基酸序列中的至少一个氨基酸序列。

31、根据本发明第一方面的任一实施方案的活性肽，所述seq id no.1所示的氨基酸序列的分子量为910.94da；

32、所述seq id no.2所示的氨基酸序列的分子量为976.02da。

33、基于本发明的第一个目的，本发明第二方面提供了一种核苷酸，所述核苷酸能够编码本发明第一方面的任一实施方案所提供的活性肽。

34、基于本发明的第一个目的，本发明第三方面提供了一种重组载体，所述重组载体含有本发明第二方面所述的核苷酸。

35、基于本发明的第一个目的，本发明第四方面提供了一种重组细胞，所述重组细胞含有本发明第二方面所述的核苷酸，或本发明第三方面所述的重组载体。

36、基于本发明的第二个目的，本发明第五方面提供了一种组合物，所述组合物包含本发明第一方面的任一实施方案所提供的活性肽。

37、基于本发明的第二个目的，本发明第六方面提供了一种具有抗炎作用的组合物，所述组合物包含本发明第一方面的任一实施方案所提供的活性肽。

38、基于本发明第一方面的任一实施方案所提供的活性肽，或者本发明第五方面提供的组合物，或者本发明第六方面提供的具有抗炎作用的组合物，本发明的第三个目的是提供所述活性肽或者组合物的用途，基于此本发明第七方面提供了所述活性肽或者组合物在制备：

39、用于治疗或预防炎症性疾病的药物中的用途；或者，

40、具有预防炎症或者消除炎症益处的饮食品中的用途；或者，

41、具有预防炎症或者消除炎症益处的化妆品中的用途。

42、根据本发明第七方面的任一实施方案的用途，包括在制备用于治疗或预防以下疾病的药物中的用途：

43、以促炎因子分泌增加为特征的炎症性疾病；或者，

44、以促炎因子il-6分泌增加为特征的炎症性疾病；或者，

45、以促炎因子il-1β分泌增加为特征的炎症性疾病；或者，

46、以lps诱导的免疫反应为特征的炎症性疾病；或者，

47、以tlr4激活为特征的炎症性疾病；或者，

48、以tlr4-md2二聚化为特征的炎症性疾病；或者，

49、以tlr4-md2二聚体的活性增加为特征的炎症性疾病。

50、基于本发明第一方面的任一实施方案所提供的活性肽，或者本发明第五方面提供的组合物，或者本发明第六方面提供的具有抗炎作用的组合物，本发明的第四个目的是提供用于预防或治疗炎症性疾病的药物组合物，基于此本发明第八方面提供了用于预防或治疗炎症性疾病的药物组合物。

51、根据本发明第八方面的任一实施方案的用于预防或治疗炎症性疾病的药物组合物，还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

52、根据本发明第八方面的任一实施方案的用于预防或治疗炎症性疾病的药物组合物，所述炎症性疾病包括败血症、败血性休克、全身炎症反应综合征、急性呼吸窘迫综合征、哮喘、过敏性和非-过敏性鼻炎、慢性和急性鼻炎、慢性和急性胃炎或肠炎、溃疡性胃炎、急性和慢性肾炎、急性和慢性肝炎、慢性阻塞性肺病、特发性肺纤维化、肠易激综合征、炎症性疼痛、偏头痛、头痛、腰痛、纤维肌痛、肌筋膜疾病、如丙型肝炎感染的病毒感染、细菌感染、真菌感染、烧伤、外科或牙科手术创伤、前列腺素e过量综合征、动脉粥样硬化、痛风、关节炎、类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、霍奇金病、胰腺炎、结膜炎、虹膜炎、巩膜炎、葡萄膜炎、皮炎、特应性皮炎、湿疹、系统性红斑狼疮以及多发性硬化症中的任意一种或者两种及以上。

53、根据本发明第八方面的任一实施方案的用于预防或治疗炎症性疾病的药物组合物，所述疾病为：

54、以炎性细胞因子表达为特征的炎症性疾病；或者，

55、以炎性体表达为特征的炎症性疾病；或者，

56、以促炎因子分泌增加为特征的炎症性疾病；或者，

57、以促炎因子il-6分泌增加为特征的炎症性疾病；或者，

58、以促炎因子il-1β分泌增加为特征的炎症性疾病；或者，

59、以lps诱导的免疫反应为特征的炎症性疾病；或者，

60、以tlr4激活为特征的炎症性疾病；或者，

61、以lps激活tlr4通路为特征的炎症性疾病；或者，

62、以tlr4-md2二聚化为特征的炎症性疾病；或者，

63、以tlr4-md2二聚体的活性增加为特征的炎症性疾病；或者，

64、以线粒体抗病毒信号蛋白的聚集为特征的炎症性疾病；或者，

65、细菌或病毒引起的炎症性疾病。

66、根据本发明第八方面的任一实施方案的用于预防或治疗炎症性疾病的药物组合物，所述活性肽的添加量为0.01～0.5mg/ml。

67、根据本发明第八方面的任一实施方案的用于预防或治疗炎症性疾病的药物组合物，所述药物或者药物组合物的剂型包括粉剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂、控速释剂、注射剂、输液剂或混悬剂。

68、根据本发明第八方面的任一实施方案的用于预防或治疗炎症性疾病的药物组合物，所述药物或者药物组合物为经胃肠消化道道给药的药物，或者经注射给药的药物，或者经皮下包埋给药方式给药的药物，或者优选为经皮下包埋给药方式给药的药物。

69、基于本发明的第五个目的，本发明第九方面提供了饮食品或者饮食品组合物，所述饮食品或者饮食品组合物包括本发明第一方面的任一实施方案所提供的活性肽，或者本发明第五方面的任一实施方案所提供的组合物，或者本发明第六方面的任一实施方案所提供的具有抗炎作用的组合物。

70、根据本发明第九方面的任一实施方案的饮食品或者饮食品组合物，所述饮食品或者饮食品组合物还包括食品上可接受的添加剂和/或辅料。

71、根据本发明第九方面的任一实施方案的饮食品或者饮食品组合物，所述饮食品或者饮食品组合物包括本发明第一方面的任一实施方案所提供的活性肽作为抗炎的有效成分，或者本发明第五方面的任一实施方案所提供的组合物作为抗炎的有效成分，或者本发明第六方面的任一实施方案所提供的具有抗炎作用的组合物作为抗炎的有效成分。

72、根据本发明第九方面的任一实施方案的饮食品或者饮食品组合物，所述活性肽的添加量为0.01～0.5mg/ml。

73、根据本发明第九方面的任一实施方案的饮食品或者饮食品组合物，所述饮食品或者饮食品组合物包括功能性食品、功能性标示食品、营养品、保健品、特别用途食品、老人用食品、病人用食品、健康辅助食品。

74、根据本发明第九方面的任一实施方案的饮食品或者饮食品组合物，所述饮食品或者饮食品组合物的剂型包括粉剂、散剂、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释剂、控速释剂、混悬剂。

75、基于本发明的第六个目的，本发明第十方面提供了化妆品或者化妆品组合物，所述化妆品或者化妆品组合物包括本发明第一方面的任一实施方案所提供的活性肽，或者本发明第五方面的任一实施方案所提供的组合物，或者本发明第六方面的任一实施方案所提供的具有抗炎作用的组合物。

76、根据本发明第十方面的任一实施方案的化妆品或者化妆品组合物，所述化妆品或者化妆品组合物还包括可接受的添加剂和/或辅料。

77、根据本发明第十方面的任一实施方案的化妆品或者化妆品组合物，所述化妆品或者化妆品组合物包括本发明第一方面的任一实施方案所提供的活性肽作为抗炎的有效成分，或者本发明第五方面的任一实施方案所提供的组合物作为抗炎的有效成分，或者本发明第六方面的任一实施方案所提供的具有抗炎作用的组合物作为抗炎的有效成分。

78、根据本发明第十方面的任一实施方案的化妆品或者化妆品组合物，所述活性肽的添加量为0.01～0.5mg/ml。

79、本发明第八方面的任一实施方案的用于预防或治疗炎症性疾病的药物或者药物组合物，或者，本发明第九方面的任一实施方案的饮食品或者饮食品组合，本发明第十方面的任一实施方案的化妆品或者化妆品组合物，具有：

80、抑制炎性细胞因子表达的用途；和/或，

81、抑制炎性体表达的用途；和/或，

82、减少促炎因子分泌的用途；和/或，

83、减少促炎因子il-6分泌的用途；和/或，

84、减少促炎因子il-1β分泌的用途；和/或，

85、促进抗炎因子分泌的用途；和/或，

86、促进抗炎因子il-10分泌的用途；和/或，

87、抑制lps诱导的免疫反应的用途；和/或，

88、抑制tlr4活性的用途；和/或，

89、抑制tlr4-md2二聚化的用途；和/或，

90、抑制tlr4-md2二聚体的活性增加的用途；和/或，

91、抑制lps激活tlr4通路的用途；和/或，

92、抑制线粒体抗病毒信号蛋白的聚集的用途；和/或，

93、抑制细菌或病毒引起的炎症的用途和/或，

94、占据tlr4-md2的活性位点的用途。

95、对于上述本发明第一方面～第八方面的任一实施方案所述的活性肽，尤其是：

96、具有如seq id no.1所示的氨基酸序列的活性肽；或具有如seq id no.2所示的氨基酸序列的活性肽；或如seq id no.1所示的氨基酸序列的活性肽；或如seq id no.2所示的氨基酸序列的活性肽；其可以通过直接提取法、人工合成法和蛋白质降解法三种途径制备得到。

97、直接提取法就是利用各种分离纯化技术，直接从自然界生物体中提取出各种生物活性肽。由于这些生物活性肽是生物体本身所含有的，并且在生物体中含量很低，如果要把这些活性肽从生物体中分离出来获得较高纯度的产物，存在难度。

98、人工合成生物活性肽的途径主要有三条：化学合成法、酶合成法和重组dna技术。其中，化学合成法主要是固相合成法和液相合成法。

99、蛋白质降解法产生的活性肽主要是以化学法和酶法水解而来。化学法主要以酸或碱断开蛋白质肽键。酶法水解生产活性肽工艺一般流程为：选择原料蛋白——预处理——酶解——分离——精制——成品。

100、进一步的，本发提供一种提取获得活性肽的方法，具体包括以下步骤：

101、第一、以甲壳纲动物的壳体为原料，进行肽的提取，具体包括：

102、a1.利用酸液处理壳体得到处理液，所述酸液具有数值≤3的ph值；

103、a2.利用碱调节所述处理液，得到提取物，所述提取物包括蛋白质；

104、a3.利用胰蛋白酶对所得提取物进行酶解操作、干燥处理，得到酶解产物，所述酶解产物包括肽；

105、第二、利用所述酶解产物的生物信息，合成得到活性肽，具体包括：

106、b1.对所述酶解产物的肽进行鉴定，确定特征多肽；

107、b2.对所述肽进行生物活性的信息筛选；

108、b3.合成纯度大于85％的活性肽；优选合成纯度大于90％的活性肽；进一步优选合成纯度大于95％的活性肽。

109、根据本发明所述提取获得活性肽的方法的任一实施方案，a1.中，所述酸液具有数值≤2.5的ph值；优选所述酸液具有数值≤2的ph值。

110、根据本发明所述提取获得活性肽的方法的任一实施方案，a1.中，按照固液比计算，所述壳体与所述酸液的混合比例为(1～10)g：(10～30)ml。混合比为(1～5)g：(15～25)ml；更加优选混合比为(1～2)g：(17～23)ml；最佳优选混合比为1g：(19～21)ml。

111、根据本发明所述提取获得活性肽的方法的任一实施方案，a1.中，所述处理时间为12～24h；所述处理温度为4～8℃。

112、根据本发明所述提取获得活性肽的方法的任一实施方案，a2.中，利用碱液调节所述处理液；其所述碱液具有数值≥10的ph值；

113、利用碱调节所述处理液，直至无明显蛋白析出得到提取物。

114、根据本发明所述提取获得活性肽的方法的任一实施方案，首选，对所述提取物进行干燥处理，然后，进行酶解操作。

115、根据本发明所述提取获得活性肽的方法的任一实施方案，a3.中，按照质量比计算，所述提取物(干重)的用量与所述胰蛋白酶的用量之比为1000～2000；

116、根据本发明所述提取获得活性肽的方法的任一实施方案，a3.中，按照质量比计算，所述提取物的用量与所述胰蛋白酶的用量之比可以为取自以下任一组数值范围内的任一数值：1000～2000、1000～1900、1000～1800、1000～1700、1000～1600、1000～1500、1000～1400、1000～1300、1000～1200、1000～1100、1100～2000、1100～1900、1100～1800、1100～1700、1100～1600、1100～1500、1100～1400、1100～1300、1100～1200、1200～2000、1200～1900、1200～1800、1200～1700、1200～1600、1200～1500、1200～1400、1200～1300、1300～2000、1300～1900、1300～1800、1300～1700、1300～1600、1300～1500、1300～1400、1400～2000、1400～1900、1400～1800、1400～1700、1400～1600、1400～1500、1500～2000、1500～1900、1500～1800、1500～1700、1500～1600、1600～2000、1600～1900、1600～1800、1600～1700、1700～2000、1700～1900、1700～1800、1800～2000、1800～1900、1900～2000。

117、根据本发明所述提取获得活性肽的方法的任一实施方案，a3.中，按照质量比计算，所述提取物的用量与所述胰蛋白酶的用量之比优选为1000～1500；进一步优选为1100～1400，更加优选为1200～1300。

118、根据本发明所述提取获得活性肽的方法的任一实施方案，a3.中，所述酶解操作在弱碱性溶液中进行ph7～9；

119、所述提取物与所述弱碱性溶液的混合比例为的混合比例为(1～10)g：(10～30)ml；优选为(1～5)g：(15～25)ml；更加优选为(1～2)g：(17～23)ml；最佳优选为1g：(19～21)ml。

120、所述胰蛋白酶与所述弱碱性溶液的混合比例为的混合比例为(1～10)mg：(10～30)ml；优选为(1～5)mg：(15～30)ml；更加优选为(1～5)mg：(20～30)ml；最佳优选为(1～2)mg：(23～27)ml。

121、根据本发明所述提取获得活性肽的方法的任一实施方案，a3.中，所述酶解操作的温度为30～40℃；优选温度为35～40℃。

122、根据本发明所述提取获得活性肽的方法的任一实施方案，a3.中，所述酶解操作的时间为10～20h；所述酶解操作的优选时间为15～20h；优选时间为10～15h；进一步优选为10～13h；更加优选为10～12h。

123、根据本发明所述提取获得活性肽的方法的任一实施方案，所述甲壳纲动物包括南美白对虾、雪蟹、龙虾及罗氏虾中的任意一种或者两种以上的组合。

124、优选，所述甲壳纲动物包括南美白对虾。

125、根据本发明所述提取获得活性肽的方法的任一实施方案，b1.中，利用液相色谱-质谱联用(lc-ms)进行鉴定，得到数据；

126、利用得到的数据进行搜库，并通过blast序列比对的方法确定所述特征多肽。

127、根据本发明所述提取获得活性肽的方法的任一实施方案，b2.中，对特征多肽的活性潜力进行评估，筛选出目标活性肽。

128、根据本发明所述提取获得活性肽的方法的任一实施方案，b3.中，合成获得所述目标活性肽。

129、本发明的任一方面的任一实施方案，在不出现矛盾的前提下，均可以与其他实施方案进行组合。此外，在本发明任一方面的任一实施方案中，在不出现矛盾的前提下，任一技术特征可以适用于其他实施方案中的该技术特征。

130、在不出现矛盾的前提下，本发明任一方面或该任一方面的任一实施方案所具有的任一技术特征同样适用其它任一实施方案或其它任一方面的任一实施方案，当然在相互之间适用时，必要时可对相应特征作适当修饰。下面对本发明的各个方面和特点作进一步的描述。

131、3.有益效果

132、相比于现有技术，本发明的有益效果为：

133、(1)本发明提供的活性肽，具有抗炎作用，能够作为抗炎组分广泛应用于药物、饮食品或化妆品领域。

134、(2)本发明提供的活性肽，能够显著减少细胞促炎细胞因子il-6和il-1β的分泌，同时提高抗炎细胞因子il-10的分泌。

135、(3)本发明提供的活性肽，能够与tlr4-md2结合，占据tlr4-md2活性位点的关键区域，抑制tlr4-md2二聚体的活性，抑制tlr4通路的活性，从而可以抑制炎症反应。

136、(4)本发明提供的具有如seq id no.1所示的氨基酸序列的活性肽，其中ayswdnr与残基arg90形成氢键，与ile117和leu 61形成疏水键，因此，所述活性肽能够占据tlr4-md2活性位点的关键区域，抑制tlr4的活性，从而抑制炎症反应。

137、(5)本发明提供的具有如seq id no.2所示的氨基酸序列的活性肽，其中agfagddapr与残基phe151、ser118、ser120、phe119、glu92和try102形成氢键，与phe121和ile94形成疏水键，因此，所述活性肽能够占据tlr4-md2活性位点的关键区域，抑制tlr4的活性，从而抑制炎症反应。