用于抑制端粒酶活性的多肽及其癌症治疗中的应用

本发明涉及一种多肽，尤其是涉及一种lpts截短的多肽及其同源物，其作为活性成分具有抑制端粒酶活性的作用，及其在制药和含药医疗器械中的应用。

背景技术：

1、研究表明超过85％的癌细胞中端粒酶被激活，而正常体细胞中没有端粒酶活性，或者活性非常低(science，23，266(5193)：2011-5)。人端粒酶能反转录合成端粒重复序列，弥补末端复制问题造成的端粒缩短，维持细胞染色体的稳定性。端粒酶被异常激活使得细胞获得永生化能力，这是细胞发生癌变的重要分子基础。端粒酶被异常激活是发生恶性肿瘤的主要因素之一，其激活及表达程度与肿瘤的发生和转移密切相关，抑制端粒酶并使端粒缩短被认为是抑制癌细胞的一种策略。因此，端粒酶成为肿瘤靶向治疗的理想靶点之一。

2、美国fda自2005年起就有靶向端粒酶的候选药物进入临床试验，用于治疗癌症和其它异常增生性疾病。目前处于临床试验的药物分为以下三类：免疫治疗、基因治疗和包括寡聚核苷酸在内的小分子抑制剂。其中，免疫治疗和寡聚核苷酸抑制剂已经进入临床iii期研究，如免疫治疗已经在肺癌和胰腺癌中完成iii期临床研究，寡聚核苷酸抑制剂imetelstat也在骨髓增生异常综合征中进行iii期临床研究，这些临床研究为靶向端粒酶的抗肿瘤药物研发提供了关键性证据。然而，这几种治疗方式都有自身的缺陷，如基因治疗的生物安全性，小分子药物的专一性，免疫治疗的生物学机制和疗效等。免疫治疗疗效低的一个主要原因是端粒酶蛋白质亚基htert是一种自身抗原，免疫细胞难以在体内对这种自身抗原发挥作用。蛋白质类药物不仅具有很高选择性和专一性，而且具有明确的生物学机制和良好的生物安全性。所以，靶向端粒酶的蛋白质抑制剂治疗策略有希望解决上述缺陷。

3、lpts是迄今为止唯一被发现的能够与端粒酶结合，抑制端粒酶延长端粒的活性的人源性蛋白质。lpts是2000年克隆得到的一个候选抑癌基因(hepatology 32(2000)721-727)。该基因位于人的8p23.1区域，这是一个染色体杂合性缺失(loh)的高频发生区域，与多种癌症的发生相关。它所编码的全长蛋白质lpts(共328aa，亦称为pinx1)能够在细胞内外结合端粒酶(cell，2001，107(3)：347-359)，起到抑制端粒酶延长端粒、诱导细胞衰老和凋亡功能。lpts与端粒酶的表达模式相反，lpts在人正常组织中均有表达，但在多种癌细胞中不表达或者低表达。增加癌细胞中lpts的表达能够有效抑制癌细胞的增殖和致瘤性，而导入它的反义寡核苷酸后能抑制细胞的增殖和致瘤性，超过94％的lpts单倍体杂合缺失小鼠体内出现肿瘤，提示lpts蛋白质或其活性区域可能具有抗癌作用，有望用于癌症的治疗。

4、早先的研究已经鉴定出2个lpts蛋白质片段，即132-328(记为：lp132)和290-328(记为：lp290)均具有较好的端粒酶抑制活性(cn200510030526.5、cn200810041324.4和cn201110184601.9)，在细胞内过表达这两个片段能抑制癌细胞生长。但是，这些片段均存在急性毒性，仍不适合作为药物开发。

5、虽然通过聚合物修饰(如：聚乙二醇化)可以降低毒性已经成为一种可以选用的手段，但是其通常会显著降低蛋白质/多肽的生物学活性，这也给药物的开发带来了巨大的挑战。

技术实现思路

1、本发明的一个目的在于提供一种多肽，其来自于lpts蛋白质，具有更强的抑制端粒酶的生物学活性，利于作为活性成分用于抗癌药物的开发。

2、本发明的另一个目的在于提供一种多肽，其来自于lpts蛋白质，具有抑制端粒酶的活性，更低的急性毒性，使用安全性提高，利于作为活性成分用于抗癌药物的开发。

3、本发明的再一个目的在于提供一种多肽，具有抑制端粒酶的生物活性，在制备治疗癌症的药物中的应用。

4、本发明的又一个目的在于提供一种多肽在制备含药医疗器械中的应用。

5、一种多肽，系lpts蛋白质片段203-328(记为：lp203)，如：seq id no 1所示。其核酸序列如：seq id no 2所示。

6、经测试，lp203与lp132相比，抑制端粒酶的活性更高，对小鼠的ld50值约为lp132的两倍，急性毒性较低。由于lp203所含的氨基酸数目少，其对生物体的免疫原性更低。lp203与lp290相比，抑制端粒酶的活性提高2-3倍，对端粒酶阳性癌细胞生长的抑制作用也显著高于后者。

7、另一种多肽，系跨膜肽tat和lp203组成的融合蛋白质(记为：tlp203)，如：seq idno 19所示，提高lp203的进入细胞膜内的效率。

8、本发明中，lp203包括与天然序列具有同源性的蛋白质或多肽。这些蛋白质或多肽可通过基因工程方式进行人为编辑和制造，也可以采用小分子或聚合物将这些与下游信号分子相结合的功能结构域进行共价结合，这些适合的小分子或聚合物是生物结合化学(bioconjugate chemistry)的一部分，并已经产生了相关的应用，比如：adc类药物、酰基化或聚乙二醇化等。

9、在一种具体的实施方案中，多肽为同源性大于98％人造lp203。

10、在另一种具体的实施方案中，多肽为同源性大于95％人造lp203。

11、在另一种具体的实施方案中，多肽为同源性大于93％人造lp203。

12、在另一种具体的实施方案中，多肽为同源性大于90％人造lp203。

13、在另一种具体的实施方案中，多肽为同源性大于85％人造lp203。

14、在另一种具体的实施方案中，多肽为同源性大于80％人造lp203。

15、在另一种具体的实施方案中，多肽为同源性大于75％人造lp203。

16、在另一种具体的实施方案中，多肽为同源性大于70％人造lp203。

17、将本发明的lp203作用于体外细胞或体内细胞，以此达成抑制端粒酶活性的目的，则应当理解为将本发明lp203作为药物使用。

18、将本发明的lp203作用于体外或体内细胞，以此实现抑制癌细胞的目的，则应当理解为将本发明lp203作为药物使用。

19、将本发明所示的lp203与其它辅料相混合，制成用于糖尿病创面修复的药物(制剂)。

20、这些药用辅料既可以是各种制剂中常规使用的，如：但不仅限于等渗剂、缓冲液、矫味剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、崩解剂和润滑剂等；也可以是为了与所述物质相适应而选择使用的，如：乳化剂、增溶剂、抑菌剂、止痛剂和抗氧剂等，这类辅料能有效提高组合物所含化合物的稳定性和溶解性或改变化合物的释放速率和吸收速率等，从而改善各种化合物在生物体内的代谢，进而增强组合物的给药效果。

21、在水溶液注射剂中，辅料一般包括等渗剂和缓冲液，以及必要的乳化剂(如：tweeen-80、pluronic和poloxamer等)、增溶剂和抑菌剂等。此外，还包括含有药学上可接受的其它药用辅料，如：抗氧剂、ph调节剂和止痛剂等。

22、用于制取口服液体制剂的辅料一般包括溶剂，以及必要的矫味剂、抑菌剂、乳化剂和着色剂等。

23、用于制取片剂的辅料一般包括填充剂(如：淀粉、糖粉、糊精、乳糖、可压性淀粉、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙和甘露醇等)、粘合剂(如：乙醇、淀粉浆、羧甲基纤维素钠、羟丙基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、明胶溶液、蔗糖溶液和聚乙烯吡咯烷酮的水溶液或醇溶液等)、崩解剂(如：干淀粉、羧甲基淀粉钠、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮和交联羧甲基纤维素钠)和润滑剂(如：硬脂酸镁、微粉硅胶、滑石粉、氢化植物油、聚乙二醇4,000、聚乙二醇6,000和月桂醇硫酸镁等)等。

24、用于制取乳剂的辅料一般为水、油(如：脂肪酸)、乳化剂，以及必要的防腐剂和矫味剂等。

25、用于制取颗粒剂的辅料与片剂类似，但造粒过程不同。根据需要，将制得的颗粒剂与助流剂混合后装入胶囊即得胶囊剂。

26、各种辅料与化合物制成有利于给药(drug delivery)的剂型，如：但不仅限于水溶液注射剂、粉针剂、丸剂、散剂、片剂、贴剂、栓剂、乳剂、霜剂、凝胶剂、颗粒剂、胶囊剂、气雾剂、喷雾剂、粉雾剂、缓释剂和控释剂等。此外，还可以为实现特定的给药目的或方式，如：缓释给药、控释给药和脉冲给药等，而使用的辅料，如：但不仅限于明胶、白蛋白质、壳聚糖、聚醚和聚酯类高分子材料，如：但不仅限于，聚乙二醇、聚氨酯、聚碳酸酯及其共聚物等。所称的“有利于给药”的主要表现有：但不仅限于提高治疗效果、提高生物利用度、降低毒副作用和提高患者顺应性等。

27、将本发明lp203与其它辅料相结合，比如：化学偶联，以进一步改善化合物的药效，降低毒作用和延长给药周期等。这些辅料通常是聚合物，比如：聚酯、聚醚和聚酰胺等。

28、将药物和医疗器械相结合制成的含药医疗器械也已经较为常见，比如：含tgf-β3的敷料。本发明的lp203还作为活性成分装载或涂覆于支架材料上，用于制成抗癌的医疗器械。常见的支架材料如：pla、plga和金属等。以及与生物相容的可降解材料相混合制成微针及其微针阵列，或者装载于金属微针中，制成微针芯片。当微针刺入皮肤后，而将lp203于真皮层中释放，利于lp203的给药，或治疗皮肤癌。

29、本发明得到的蛋白质片段是基于lpts蛋白质序列结构分析的基础上，通过详细分段、活性对比分析的方法筛选到的，是lpts蛋白质中活性较高、长度较短的活性区域，是一个优选片段，即在保证高抑制端粒酶活性的前提下，尽量缩短蛋白质片段的长度，以达到降低蛋白质免疫原性和体内毒性的目的。所采用了制备方法是中试规模的工业上常用的分离纯化方法，适于工业放大，利于lp203蛋白质进一步研究和应用。