基因工程菌株HO-1-B1及其应用

本发明属于环境微生物。

背景技术：

1、生物脱氮目前被认为是污水氮素去除最为经济有效的方式。传统的生物脱氮技术是由硝化作用和反硝化作用两个过程协同完成脱氮，即先由自养型的硝化细菌在好氧条件下进行硝化作用，将氨氮(nh4+)转变成亚硝态氮(no2--n)或者硝态氮(no3--n)，然后再由异养型的反硝化细菌在厌氧条件下进行反硝化作用，把亚硝态氮(no2--n)或者硝态氮(no3--n)还原为气态氮(n2o、n2)。

2、已有技术1(专利号：cn111218410b)提供了一株能独立将nh4+转化为气态氮产物(n2o、n2)的菌株ho-1，在处理含氨氮废水时，可实现单一菌株单一条件下的全程脱氮，在操作和经济效益上比传统的好氧硝化-厌氧反硝化的生物脱氮工艺更具优势。该技术提供一株产碱菌(alcaligenes sp.)菌株ho-1 cgmcc no.16549，所述菌株为异养型细菌，其脱氮在好氧条件下进行，可独立将氨氮转化为气态氮产物(n2o、n2)，即一个菌株在好氧的条件下完成全程脱氮。但该菌株所利用的碳源为小分子有机酸，在应用于生物脱氮领域时需为该菌株提供合适的小分子有机酸类碳源，目前为止，在水处理中常用的外加碳源一般是水溶性的，极易被微生物利用，但需要精密控制投加的剂量以防止有毒物质的形成。此外，这类外加碳源自身没有选择性，可以被任何微生物包括病原微生物利用。因此水质和生态平衡可能受到影响或干扰。

3、碳源是传统生物脱氮过程中的一个重要因素，当水体中碳氮质量比过低时，往往需要投加外加碳源作为电子供体,以保证反硝化反应的顺利进行。按照种类可分为以小分子有机物及糖类物质为主的传统碳源，还有以天然纤维素物质、人工合成高聚物、骨架型复合缓释碳源为主的新型固体碳源。另外，新型固体碳源可以作为一种微生物固定化技术将游离微生物限制或定位在某一特定空间范围内，保留其固有的生化特性，且能够被重复和连续使用，构成一种高效、快速、耐受性强、能连续处理的微生物脱氮技术，可以有效地减少二次污染。新型固体碳源耦合固定化技术近几年发展迅速，在养殖废水处理中的应用与日俱增，受到越来越广泛的关注。

4、已有技术2(专利号：zl201910661583.5)提供了一株能利用phas作为固体缓释碳源去除水体硝态氮的菌株及其好氧脱氮菌剂制备方法及应用。该菌株因其能分泌胞外解聚酶，能高效利用固体缓释碳源并固定化在高分子聚合物载体上，形成好氧脱氮菌剂应用于养殖循环水去除水体中积累的硝态氮。该技术提供一株能利用缓释碳源pha的菌株aob-7，所述菌株能利用phas作为固体缓释碳源及载体进行高效好氧脱氮，基于菌株aob-7开发出以pha颗粒作为固体缓释碳源和生物膜载体的新型好氧脱硝酸盐氮制剂，可以直接添加到低碳氮比水体(如水产养殖池)中而改善水质。但该菌株无法利用污染水体中更高毒性的氨氮，存在技术缺陷。

技术实现思路

1、有鉴于此，一个有效的替代方案是应用不溶性固体缓释碳源作为电子供体与固定载体进行一步除氨的异养硝化过程。固体碳源仅被特定的一步除氨微生物降解，不仅达到了碳源稳定供应的目的，而且为一步除氨微生物提供了生长附着的场所，提高氨氮的去除效果。

2、第一方面，本发明提供了一种可利用固体phas碳源的基因工程一步除氨菌的构建方法，所述方法通过多步骤的酶切-连接法构建获得由一步除氨菌自身的启动子、信号肽、密码子目的基因组成的基因工程重组表达质粒；或者通过overlap pcr获得由一步除氨菌自身的启动子、信号肽、目的基因组成的基因片段表达盒，将表达盒与线性化广宿主穿梭表达载体连接，得到重组质粒。具体地，该方法包括广宿主表达载体的选择、构建适配表达元件(启动子改造)、构建适配密码子体系(phas胞外解聚酶基因的密码子优化)、构建适配分泌表达元件(适合一步除氨菌株分泌phas胞外解聚酶的信号肽选择)、一步除氨菌株的感受态制备、通过电转化手段将重组质粒导入一步除氨菌株的感受态细胞从而获得能成功表达phas胞外解聚酶的一步除氨菌株等步骤。

3、第二方面，本发明提供了一株基因工程菌株ho-1-b1，所述基因工程菌株ho-1-b1是将重组质粒pbbr1mcs-p238-sp-op-depoly电转入菌株ho-1感受态细胞中获得；所述重组质粒pbbr1mcs-p238-sp-op-depoly是将重组质粒pbbr1mcs-p238-sp与op-depoly连接获得；所述op-depoly基因序列如序列表seq id no.3所示；所述重组质粒pbbr1mcs-p238-sp是将表达质粒pbbr1mcs-p238与信号肽sp连接获得；所述信号肽sp基因序列如序列表seqid no.2所示；所述表达质粒pbbr1mcs-p238是将表达质粒pbbr1mcs与启动子p238基因序列链接获得；所述启动子p238基因序列如序列表seq id no.1所示。

4、第三方面，本发明还提供了基于基因工程菌株ho-1-b1的一步除氨制剂的制备方法，所述一步除氨制剂是将基因工程菌株ho-1-b1接入含有生物可降解材料的培养基中发酵培养，所得可降解材料与基因工程菌株形成的共同体即为一步除氨制剂。

5、进一步地，所述一步除氨制剂的制备方法包括以下步骤：将基因工程菌株ho-1-b1按照1-2％v/v的接种量接种于含0.5～140mg/lnh4+-n的hnm-pha培养基中，于25～30℃、120～160rpm条件下摇床培养60-72h，取出培养体系中的pha颗粒，所得pha颗粒和ho-1-b1形成的共同体即为一步除氨制剂。

6、其中，所述含0.5～140mg/l nh4+-n的hnm-pha培养基的组成如下：每升培养基中，nh4cl 0.019～0.535g，pha 1.5g～3.0g，mgso4·7h2o 0.10～0.20g，cacl2 0.005～0.01g，kh2po4 0.50～0.80g，na2hpo4 0.50～0.80g，feso4 0.01～0.02g，nacl 10.00～30.00g，微量元素1.00-2.00ml，ph 7.0～7.5；所述微量元素组成如下：48.20～57.10g/l edta·2na，2.80～3.90g/l znso4·7h2o，5.00～7.00g/lcacl2·2h2o，0.50～1.00g/l mncl2·4h2o，3.00～5.00g/l feso4·7h2o，0.75～1.10g/l(nh4)6mo7o24·4h2o，0.90～1.60g/l cuso4·5h2o，0.90～1.60g/l cocl2·6h2o，ph 6.0～6.5。

7、第四方面，本发明还提供了所述基因工程菌株ho-1-b1及所述一步除氨制剂在溶液中去除氨氮中的应用。

8、第五方面，本发明还提供一种低碳氮比水体一步除氨处理方法，所述方法包括：向低碳氮比水体中加入固体缓释碳源，然后接入所述基因工程菌ho-1-b1或直接向水体中加入所述一步除氨制剂，进行一步除氨处理。或者，向低碳氮比水体中加入上述任一种或多种一步除氨制剂，进行一步除氨处理。

9、本发明的工程菌株以及一步除氨制剂可以去除溶液中更高毒性的氨氮，无需把氨氮转化为亚硝酸盐氮、硝酸盐氮再经好氧反硝化菌株转化为气态氮产物，只利用所述功能菌株一株菌，即可实现在低碳氮比水体或养殖水体中去除更高毒性的氨氮。