Cfap46基因敲除小鼠动物模型的构建方法及应用与流程

本发明属于生物医药领域，涉及一种基于crispr/cas9技术的cfap46基因敲除小鼠动物模型的构建方法与应用。

背景技术：

1、据统计，全球约有10％-15％的夫妇患有不孕症，在不孕症患者中男性因素约占50％。精子鞭毛多发形态异常(mmaf)可导致男性不育。mmaf的表型主要包括：精子鞭毛卷曲、弯曲、不规则、短或无鞭毛。先前的研究已经确定了几个与鞭毛相关的基因，包括akap3、akap4、ttc21a、ttc29、fsp2、dnah1、dnah2、dnah6、dnah8、dnah17和dzip1，参与精子鞭毛生物发生。同时，纤毛和鞭毛相关蛋白(cfap)家族，如cfap58、cfap61、cfap69、cfap65、cfap43、cfap44、cfap70和cfap251，也与鞭毛的生物发生和形态发生有关。这些基因发生突变后，可能影响精子的形态，导致男性不育。

2、鞭毛和纤毛相关基因46(cfap46)(ncbi参考序列：nm_001302546；

3、ensmusg00000049571：ensmusg00000049571)位于小鼠7号染色体上，全长83872bp。cfap46基因编码cfap46蛋白，cfap46是纤毛微管基细胞骨架的中央器官的一部分。在人类中，纤毛和鞭毛相关蛋白家族基因的改变与鞭毛形态学异常有关。cfap46基因主要在睾丸中表达，在其他组织中表达量较低(肺、卵巢中少量表达)。因此，cfap46基因在精子形成过程中可能发挥重要作用。

4、目前，关于cfap46基因的研究相对较少。有研究表明，哮喘和神经管缺陷可能与cfap46基因的甲基化相关。cfap46基因还可能与vti1a基因融合成新的转录本参与肝细胞癌的发生。在生殖方面，选择具有最佳受精潜力的精子是辅助生殖技术中面临的主要挑战之一，这种选择主要是基于精液参数。在高质量和低质量精子样本中，cfap46基因的表达量存在差异，cfap46基因的表达与精子的形态相关。然而，cfap46基因是否会影响生育能力目前尚未可知。本发明创建了cfap46基因敲除小鼠模型，为进一步探究cfap46基因对生育能力的影响提供可能。

技术实现思路

1、本发明旨在基于crispr/cas9技术提供一种cfap46基因敲除小鼠动物模型的构建方法及应用。

2、第一方面，本发明涉及一种cfap46基因敲除小鼠动物模型的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：

3、s1，确定cfap46基因的特异性靶位点grna1和grna2，并与cas9核酸酶体外转录成mrna，即cas9rna；

4、s2，将有活性的grna1、grna2和cas9rna显微注射入小鼠受精卵中，获得cfap46基因敲除小鼠；

5、所述grna1：tccccggactgtgcataagctgg(seq id no.1)；

6、grna2：tcagtttgccacggtgcgtccgg(seq id no.2)。

7、所述步骤s2包括以下步骤：

8、s21，使雌鼠促排卵和体外受精，培育受精卵；

9、s22，将有活性的grna1、grna2和cas9rna显微注射到小鼠受精卵中；受精卵体外培养、植入受体及靶向基因修饰动物的培育。

10、所述步骤s22包括以下步骤：

11、s221，取注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠体内，产出小鼠，假孕母鼠繁殖所得为f0代单基因或多基因的杂合小鼠模型；

12、s222，提取f0代小鼠尾部dna，pcr扩增并将产物送测序；

13、s223，将f0代单基因或多基因的杂合小鼠与野生小鼠合笼繁殖所得为f1代单基因或多基因的杂合小鼠；

14、s224，相同基因型f1代小鼠合笼繁育，得到纯合子突变型小鼠，即f2代cfap46基因敲除小鼠模型。

15、以上所述的小鼠、雌鼠和假孕母鼠为c57bl/6j小鼠。

16、进一步地，所述阳性f0代小鼠cfp46基因删除了4.391kb个碱基，所述阳性f0代小鼠cfap46基因删除的碱基序列如seq id no.3所示。

17、进一步地，用cfap46-seq-f1+cfap46-seq-r1和cfap46-seq-f2+cfap46-seq-r1两对引物对f2代小鼠分别进行pcr检测，鉴定出f2代纯合子小鼠；

18、引物cfap46-seq-f1的序列：aaagagcctgagataagcgaagac(ko专用)，如seq idno.4所示；

19、引物cfap46-seq-f2的序列：tggcaggctatttagcgtttacat(wt专用)，如seq idno.5所示；

20、引物cfap46-seq-r1的序列：gggcaatcacaattccatcatctc(下游公用引物)，如seqid no.6所示。

21、所述f2代纯合子小鼠基因组序列删除了4.391kb个碱基，删除的4.391kb个碱基如seq id no.3所示。

22、第二方面，本发明涉及一种cfap46基因打靶载体，所述载体是基于crispr/cas9系统的一组sgrna表达载体；所述sgrna为在cfap46基因外显子3和4之间的cfap46-grna1，在cfap46基因外显子8和9之间的cfap46-grna1；所述sgrna的作用位点的序列如seq id no:1和seq id no:2所示。

23、第三方面，本发明涉及一种一组sgrna在构建生育能力研究的cfap46基因敲除小鼠动物模型中的用途。

24、第四方面，本发明涉及一种前面所述制备得到的cfap46基因敲除小鼠动物模型在生育能力研究中的应用。

25、本发明具有如下有益效果：

26、本发明筛选了针对cfap46基因的特异性靶点grna1和grna2，使用crispr/cas9基因敲除技术，构建了cfap46基因打靶载体，首次建立了cfap46基因敲除的小鼠动物模型，为研究cfap46基因与生育能力的关系提供便捷、可靠的动物模型，特别是在研究雄性动物生育能力与cfap46基因的关系以及相关治疗药物筛选中提供了便捷、可靠的动物模型。

技术特征：

1.一种cfap46基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.根据权利要求1所述的cfap46基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤s2包括以下步骤：

3.根据权利要求1或2所述的cfap46基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，步骤s22包括以下步骤：

4.根据权利要求1-3任一项所述的cfap46基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述小鼠、雌鼠和假孕母鼠为c57bl/6j小鼠。

5.根据权利要求2所述的cfap46基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述阳性f0代小鼠cfp46基因删除了4.391kb个碱基，所述阳性f0代小鼠cfap46基因删除的碱基序列如seq id no.3所示。

6.根据权利要求3所述的cfap46基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，

7.根据权利要求3所述的cfap46基因敲除小鼠动物模型的构建方法，其特征在于，所述f2代纯合子小鼠基因组序列删除了4.391kb个碱基，删除的4.391kb个碱基如seq id no.3所示。

8.一种cfap46基因打靶载体，其特征在于，所述载体是基于crispr/cas9系统的一组sgrna表达载体；所述sgrna为在cfap46基因外显子3和4之间的cfap46-grna1，在cfap46基因外显子8和9之间的cfap46-grna1；所述sgrna的作用位点的序列如seq id no:1和seq idno:2所示。

9.一种如权利要求8所述的一组sgrna在构建生育能力研究的cfap46基因敲除小鼠动物模型中的用途。

10.一种如权利要求1-7或权利要求8所述任一项制备得到的cfap46基因敲除小鼠动物模型在生育能力研究中的应用。

技术总结本发明公开了一种用于生育能力研究的Cfap46敲除小鼠模型的构建方法及其应用。通过CRISPR/cas9介导的基因组工程技术建立Cfap46基因敲除小鼠模型(C57BL/6J)，其构建方法包括：确定Cfap46基因的特异性靶位点gRNA1和gRNA2，并与Cas9核酸酶体外转录成mRNA；将有活性的gRNA1、gRNA2和Cas9RNA显微注射入小鼠受精卵中，获得Cfap46基因敲除小鼠；对构建的Cfap46基因敲除小鼠模型进行鉴定，并验证其雌性和雄性的生育能力。本发明使用CRISPR/Cas9基因敲除技术首次建立了Cfap46基因敲除的小鼠动物模型，为研究Cfap46基因与生育能力的关系提供便捷、可靠的动物模型。技术研发人员：陈厚仰,罗韬,程成,何远桥受保护的技术使用者：南昌乐悠生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18