核苷酸片段冻干微球的冻干保护剂及其冻干微球制备方法与流程

本发明涉及核酸检测，具体为核苷酸片段冻干微球的冻干保护剂及检测方法。

背景技术：

1、核酸检测由于其灵敏度高、特异性强、操作简便、所需时间短等特点，已广泛应用于临床医学、检验检疫等多个领域，尤其在聚合酶链式反应(英文：polymerasechainreaction，简称：pcr)、等温扩增等核酸扩增技术中。

2、质控品是一种稳定的物质，用于检查分析仪器或方法的性能。阴阳性质控品是用来监控试剂盒在整个检测过程中的稳定性和准确性，包括从样本提取到扩增的全过程。

3、液体试剂需要解决很多稳定性问题：蛋白变性(裂解和聚集)，蛋白的三维空间结构，溶液微生物环境、ph值变化、温度耐受等问题。溶液内部的分子运动，带来了很多不确定因素。因此，试剂如果想长期稳定保存，一般都需要冻干和冻存的方式，固态形式保证分子的结构稳定性。低温固化后，并且在低温真空环境下干燥，产品的结构不发生任何变化。在筛选合适的冻干保护剂下，构建了一个稳定的三维空间，如果再加入惰性气体保护，产品的稳定性是液体试剂无法比拟的。质控品，最好的形式是冻干。目前多采用西林瓶冻干方式，西林瓶冻干产线在制药领域比较完善，可以排除很多干扰因素。但对于诊断试剂的应用，会带来一些问题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供核苷酸片段冻干微球的冻干保护剂及检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。

2、核苷酸片段冻干微球的冻干保护剂，由以下材料组成：bsa、聚合物、海藻糖、填充剂、表面活性剂、dnase/rnase-free水，1000ml的所述冻干保护剂各组成材料组分如下：

3、bsa 1g～10g；

4、聚合物5g～35g；

5、海藻糖10g～100g；

6、填充剂30g～100g；

7、表面活性剂0.3～1.5ml；

8、dnase/rnase free水补足1000ml。

9、作为本发明的进一步改进，所述冻干保护剂每1000ml各组成材料组分如下：

10、bsa 1g；

11、聚合物20g；

12、海藻糖50g；

13、填充剂60g；

14、表面活性剂0.6ml；

15、dnase/rnase free水补足1000ml。

16、作为本发明的进一步改进，所述聚合物包括聚乙二醇peg6000、peg8000和peg20000中的任意一种。

17、作为本发明的进一步改进，所述填充剂为甘露醇。

18、作为本发明的进一步改进，所述表面活性剂包括tween20和tween80中的任意一种。

19、本发明还提供了核苷酸片段冻干微球的制备方法，本制备方法为将冻干保护剂与核苷酸片段溶液混合，进行冷冻干燥，得到含核苷酸片段冻干微球。

20、作为本发明的进一步改进，所述冷冻干燥包括以下步骤：

21、s1、预冻阶段：预冻温度为-60℃～-40℃，压力为5pa以下，时间为1～3h；

22、s2、升华干燥；

23、s3、解析干燥。

24、作为本发明的进一步改进，所述冻干保护剂与核苷酸片段溶液的体积比为1～10：1；所述核苷酸片段溶液的浓度为106～103copies/ml工作液浓度。

25、作为本发明的进一步改进，所述步骤s2包括2个阶段，第1阶段的温度为-50℃～-40℃，时间为10～14h，第2阶段的温度为-25℃～-20℃，时间为2～6h，两个阶段压力均为10pa以下；

26、所述步骤s3包括2个阶段，第1阶段的温度为-20℃～0℃，时间为0.5～2h，第2阶段为20℃～30℃，时间为2～8h，压力均为5pa以下。

27、本发明还提供了核苷酸片段冻干微球的应用，所述核苷酸片段冻干微球应用在pcr试验中，具体为核苷酸片段冻干微球溶解后取一定量与含引物探针的pcr扩增试剂混合，pcr仪扩增后，得到扩增试验结果。

28、与现有技术相比，本发明的有益效果是：

29、本发明中冻干微球冻干脱水彻底，含水量低，重量轻，适合长途运输及长期保存，每个微球单独封装，由于冻干是在真空和低温状态下完成的，因此不易发生氧化和热变性，可以最大限度地保持理化性质和生物特性，不像冻干粉可能会出现堆积和结块；更方便使用：冻干微球可以按需取出使用；保证产品品质：冻干微球结构稳定，不易受到影响，可以避免冻干粉在储存和运输过程中质量受损的问题；更高的生物利用度：固态的冰晶升华成为水蒸气后形成的疏松多孔(海绵状)结构，使冻干具有极好的速溶性和复水性，可迅速吸水溶解，恢复其原有特性，尤其适合用于中小型实验室或者现场实验操作。

技术特征：

1.核苷酸片段冻干微球的冻干保护剂，其特征在于：由以下材料组成：bsa、聚合物、海藻糖、填充剂、表面活性剂、dnase/rnase-free水，1000ml的所述冻干保护剂各组成材料组分如下：

2.根据权利要求1所述的核苷酸片段冻干微球的冻干保护剂，其特征在于：所述冻干保护剂每1000ml各组成材料组分如下：

3.根据权利要求1所述的核苷酸片段冻干微球的冻干保护剂，其特征在于：所述聚合物包括聚乙二醇peg6000、peg8000和peg20000中的任意一种。

4.根据权利要求1所述的核苷酸片段冻干微球的冻干保护剂，其特征在于：所述填充剂为甘露醇。

5.根据权利要求1所述的核苷酸片段冻干微球的冻干保护剂，其特征在于：所述表面活性剂包括tween20和tween80中的任意一种。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的核苷酸片段冻干微球的制备方法，其特征在于：本制备方法为将冻干保护剂与核苷酸片段溶液混合，进行冷冻干燥，得到含核苷酸片段冻干微球。

7.根据权利要求6所述的核苷酸片段冻干微球的制备方法，其特征在于：所述冷冻干燥包括以下步骤：

8.根据权利要求6所述的核苷酸片段冻干微球的制备方法，其特征在于：所述冻干保护剂与核苷酸片段溶液的体积比为1～10：1；所述核苷酸片段溶液的浓度为106～103copies/ml工作液浓度。

9.根据权利要求7所述的核苷酸片段冻干微球的制备方法，其特征在于：所述步骤s2包括2个阶段，第1阶段的温度为-50℃～-40℃，时间为10～14h，第2阶段的温度为-25℃～-20℃，时间为2～6h，两个阶段压力均为10pa以下；

10.根据权利要求1-9任一项所述的核苷酸片段冻干微球的应用，其特征在于：所述核苷酸片段冻干微球应用在pcr试验中，具体为核苷酸片段冻干微球溶解后取一定量与含引物探针的pcr扩增试剂混合，pcr仪扩增后，得到扩增试验结果。

技术总结本发明公开核苷酸片段冻干微球的冻干保护剂，由以下材料组成：BSA、聚合物、海藻糖、填充剂、表面活性剂、DNase/RNase‑Free水，1000ml的所述冻干保护剂各组成材料组分如下：BSA1g～10g；聚合物5g～35g；海藻糖10g～100g；填充剂30g～100g；表面活性剂0.3～1.5mL；DNase/RNase Free水补足1000mL。本发明能够起到维持冻干球球体，起到冻干成球的作用，并且这几种组分的添加能够有效维持核苷酸片段稳定性，达到室温保存的目的，使核苷酸片段可以固态形式体现，延长核苷酸片段的有效期，有效扩宽了核苷酸序列保存和使用条件。技术研发人员：何伟,张佩佩,陈世兴,倪佳欢受保护的技术使用者：江苏格诺生物科技有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18