抗丙氨酰-tRNA合成酶单链抗体及其制备方法与流程

本申请属于生物医学，更具体地说，是涉及一种抗丙氨酰-trna合成酶单链抗体及其制备方法。

背景技术：

1、噬菌体展示是一种基于基因工程原理的重组表达技术，应用该技术将编码外源蛋白的核苷酸序列定点插入至噬菌体表面外壳蛋白基因组中，通过噬菌体的复制增殖进行大量表达，从而展示在噬菌体表面形成抗原、抗体等文库，再通过多轮淘选最终获得满足需求的目标产物。

2、抗合成酶综合征是属于特发性肌炎的一类自身免疫性疾病，其血清学特征为存在针对细胞质氨酰基-trna合成酶(aarss)的自身抗体，临床特征包括间质性肺病、肌炎、雷诺现象、关节炎、技工手和发烧等。针对丙氨酰-trna合成酶的自身抗体，也被称为抗pl-12抗体，是bunn等人在1986年发现的第三种肌炎特异性自身抗体。抗pl-12igg可以独立识别两种抗原：丙氨酰-trna合成酶及其同源trna，这种识别是通过单独的自身抗体发生的。

3、目前还没有关于抗丙氨酰-trna合成酶单链抗体的相关报道。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题为：如何解决获得抗丙氨酰-trna合成酶单链抗体。

2、第一方面，本发明提供一种抗丙氨酰-trna合成酶单链抗体，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的dna序列如seq id no：1所示，所述轻链可变区的dna序列如seq id no：2所示。

3、作为一种可能的设计，重链cdr区氨基酸序列为vhcdr1如seq id no：3所示，vhcdr2如seq id no：4所示，vhcdr3如seq id no：5所示；轻链cdr区氨基酸序列为vlcdr1如seq id no：6所示，vlcdr2如seq id no：7所示，vlcdr3如seq id no：8所示。

4、第二方面，本发明提供一种抗丙氨酰-trna合成酶单链抗体的制备方法，包括：

5、s1.提取免疫小鼠的脾脏总rna，经由rt-pcr、pcr扩增重链可变区和轻链可变区序列，再经重叠延伸pcr扩增获得scfv；

6、s2.scfv与pcantab5e噬菌体质粒双酶切后进行连接；

7、s3.pcantab5e-scfv连接产物电转至感受态细胞，加入辅助噬菌体拯救，获得scfv抗体库；

8、s4.使用靶标抗原包被酶标板，进行3-5轮抗体库淘选，获得效价最高的scfv。

9、作为一种可能的设计，所述免疫小鼠是指能够合成全长丙氨酰-trna合成酶蛋白的小鼠；rt-pcr引物为oligo(dt)18，重链可变区pcr引物为：vhf1如seq id no：9所示，vhf2如seq id no：10所示，vhf3如seq id no：11所示，vhf4如seq id no：12所示，vhr1如seq idno：13所示，vhr2如seq id no：14所示，vhr3如seq id no：15所示；轻链可变区pcr引物为：vlf1如seq id no：16所示，vlf2如seq id no：17所示，vlf3如seq id no：18所示，vlf4如seq id no：19所示，vlr1如seq id no：20所示，vlr2如seq id no：21所示，vlr3如seq idno：22所示；重叠延伸pcr引物为：scfv f sfi i如seq id no：23所示，scfv r not i如seqid no：24所示。

10、作为一种可能的设计，步骤s2中scfv与pcantab5e噬菌体质粒分别经由sfi i与not i双酶切后进行连接。

11、作为一种可能的设计，步骤s3中所述感受态细胞为大肠杆菌tg1。

12、作为一种可能的设计，步骤s3中所述噬菌体为m13k07。

13、作为一种可能的设计，步骤s4中所述靶标抗原为人细胞质丙氨酰-trna合成酶，抗原氨基酸序列为丙氨酰-trna合成酶全长氨基酸(ncbi seq.：np_001596.2)，构建his标签融合蛋白于hek293细胞中表达，经由镍柱亲和层析得到。

14、作为一种可能的设计，步骤s2中重链上游引物引入sfi i酶切位点与保护碱基，轻链下游引物引入not i酶切位点与保护碱基。

15、作为一种可能的设计，重链下游引物与轻链上游引物中引入15个氨基酸(gly4ser)3的序列作为连接序列。

16、本发明的有益效果为：

17、应用本实验室制备的丙氨酰-trna合成酶抗原免疫健康小鼠，测定抗体效价合格后取脾脏提取rna，经由rt-pcr、pcr、重叠延伸pcr的方式获得scfv，与pcantab5e载体连接后电转得到噬菌体抗体文库，进行多轮筛选，得到高效价的抗体序列，本发明具有抗体库容量大、操作相对简便、成本低等优点，为进一步应用于体外诊断试剂盒奠定基础，具有广阔应用前景。

技术特征：

1.一种抗丙氨酰-trna合成酶单链抗体，其特征在于，所述抗丙氨酰-trna合成酶单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的dna序列如seq id no：1所示，所述轻链可变区的dna序列如seq id no：2所示。

2.根据权利要求1所述的抗丙氨酰-trna合成酶单链抗体，其特征在于，重链cdr区氨基酸序列为vhcdr1如seq id no：3所示，vhcdr2如seq id no：4所示，vhcdr3如seq id no：5所示；轻链cdr区氨基酸序列为vlcdr1如seq id no：6所示，vlcdr2如seq id no：7所示，vlcdr3如seq id no：8所示。

3.一种权利要求1或2所述的抗丙氨酰-trna合成酶单链抗体的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：

4.根据权利要求3所述的抗丙氨酰-trna合成酶单链抗体的制备方法，其特征在于，所述免疫小鼠是指能够合成全长丙氨酰-trna合成酶蛋白的小鼠；rt-pcr引物为oligo(dt)18，重链可变区pcr引物为：vhf1如seq id no：9所示，vhf2如seq id no：10所示，vhf3如seqid no：11所示，vhf4如seq id no：12所示，vhr1如seq id no：13所示，vhr2如seq id no：14所示，vhr3如seq id no：15所示；轻链可变区pcr引物为：vlf1如seq id no：16所示，vlf2如seq id no：17所示，vlf3如seq id no：18所示，vlf4如seq id no：19所示，vlr1如seq idno：20所示，vlr2如seq id no：21所示，vlr3如seq id no：22所示；重叠延伸pcr引物为：scfv f sfi i如seq id no：23所示，scfv r not i如seq id no：24所示。

5.根据权利要求3所述的抗丙氨酰-trna合成酶单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤s2中scfv与pcantab5e噬菌体质粒分别经由sfi i与not i双酶切后进行连接。

6.根据权利要求3所述的抗丙氨酰-trna合成酶单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤s3中所述感受态细胞为大肠杆菌tg1。

7.根据权利要求3所述的抗丙氨酰-trna合成酶单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤s3中所述噬菌体为m13k07。

8.根据权利要求3所述的抗丙氨酰-trna合成酶单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤s4中所述靶标抗原为人细胞质丙氨酰-trna合成酶，抗原氨基酸序列为丙氨酰-trna合成酶全长氨基酸(ncbi seq.：np_001596.2)，构建his标签融合蛋白于hek293细胞中表达，经由镍柱亲和层析得到。

9.根据权利要求3所述的抗丙氨酰-trna合成酶单链抗体的制备方法，其特征在于，步骤s2中重链上游引物引入sfi i酶切位点与保护碱基，轻链下游引物引入not i酶切位点与保护碱基。

10.根据权利要求9所述的抗丙氨酰-trna合成酶单链抗体的制备方法，其特征在于，重链下游引物与轻链上游引物中引入15个氨基酸(gly4ser)3的序列作为连接序列。

技术总结本申请提供了一种抗丙氨酰‑tRNA合成酶单链抗体及其制备方法，抗丙氨酰‑tRNA合成酶单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，所述轻链可变区的DNA序列如SEQ ID NO：2所示。应用本实验室制备的抗原免疫健康小鼠，测定抗体效价合格后取脾脏提取RNA，经由RT‑PCR、PCR、重叠延伸PCR的方式获得ScFv，与pCANTAB5e载体连接后电转得到噬菌体抗体文库，进行多轮筛选，得到高效价的抗体序列，本发明具有抗体库容量大、操作相对简便、成本低等优点，为进一步应用于体外诊断试剂盒奠定基础，具有广阔应用前景。技术研发人员：舒松林,柳乐,王健,周献军,黄敬双,鲜静,张伟,曾红受保护的技术使用者：四川携光生物技术有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18