一种FGF21基因缺失斑马鱼的构建方法及应用

本发明涉及一种fgf21基因缺失斑马鱼的构建方法及应用，属于动物模型领域。

背景技术：

1、成纤维细胞生长因子21(fgf21)是一种源自肝脏的内分泌激素，对身体发挥多效作用以维持整体代谢稳态。在过去的十年中，人们付出了巨大的努力来了解fgf21在调节代谢中的生理作用，并确定其在逆转糖尿病和肥胖症中的有效药理作用。此外，fgf21在机体的生长、发育、能量代谢、繁殖等诸多方面发挥着重要作用。

2、fgf21基因作为一个重要的能量调节因子，虽然关于该基因的研究报道大量涌现，但是其研究模型大多是后期构建，并没有在基因层面上构建fgf21基因缺失模型。且目前的研究重点为该基因在糖尿病和肥胖症中的作用。

3、crispr/cas系统具有编辑dna的功能，是近年来得到快速发展的一项用于基因编辑的工具，有着比传统基因编辑技术zfns(zinc-finger nucleases)和talens(transcription activator-like effectors)更便利，应用更广的优点。ⅱ型crispr/cas系统(the typeⅱclustered regularly interspaced short palindromic repeatssystem/crispr-associated)来自于streptococcus pyogenes，是属于原核生物适应性免疫的一部分，保护细菌和古生菌避免入侵性病毒和质粒的伤害。cas9是ⅱ型crispr/cas系统的一部分，能够在grna的引导下对外源性dna进行剪切。在斑马鱼胚胎中，使用cas9/grnasystem可有效的进行特异性位点的切割，导致非同源末端连接介导的插入或缺失，或通过hdr机制在基因组中引入一小段外源dna。

4、斑马鱼作为一种典型的模型生物，与人类基因同源性达87％。容易在实验室养殖，繁殖力高，一条雌鱼一次可产数百粒卵，可持续提供大量胚胎材料共分析研究之用。卵和胚胎透明，体外受精，体外发育，便于在不受损害的情况下进行连续跟踪观察。卵子比一般哺乳动物卵子大10倍，外源物质包括外源基因可以通过显微注射引入到胚胎中。胚胎发育速度快，24h便可完成从受精卵到形成主要组织器官的发育过程，幼鱼发育到性成熟其约需要3-4个月。成体斑马鱼个体小，便于大规模的养殖和大规人工诱变和突变体的筛选。胚胎学和遗传学技术成熟。另外，斑马鱼的基因组测序早已完成，遗传背景清晰，在进行基因编辑上有很大的便利和优势。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种fgf21基因缺失斑马鱼的构建方法及应用。

2、本发明的第一方面，公开了一种fgf21基因缺失斑马鱼的构建方法，包括如下步骤：

3、1)根据crispr/cas9，在fgf21基因第3外显子确定了fgf21基因的靶点，序列为5’ggagctgcgttcagtcaaag3’，在靶点序列前端添加启动子序列，在靶点后端添加grna识别序列，合成fgf21-grna序列；

4、2)对fgf21-grna进行体外转录，提取纯化；

5、3)将纯化的fgf21-grna和cas9蛋白显微注射至斑马鱼一细胞期的胚胎，培养获得fgf21纯合子突变体；

6、fgf21基因缺失斑马鱼是通过crispr/cas9靶向基因敲除斑马鱼fgf21基因的3号外显子第217号碱基a得到的。

7、本发明的第二方面则提供了一种肝脏发育缺陷、早期发育迟缓的斑马鱼模型，所述的斑马鱼模型为fgf21基因缺失斑马鱼，fgf21基因缺失斑马鱼是通过crispr/cas9靶向基因敲除斑马鱼fgf21基因的3号外显子第217号碱基a得到的。

8、肝脏发育缺陷模型，是模拟人类从新生儿发育至成人过程中肝脏发育异常(偏小)的疾病模型。此外，临床中新生儿早期发育迟缓也是常见病症。

9、在优选的实施方案中，所述的fgf21基因缺失斑马鱼为fgf21纯合子突变体，其表型为幼鱼期延迟发育进度、成鱼期肝脏发育缺陷。

10、进一步地，野生型fgf21蛋白含有194个氨基酸，而fgf21基因缺失斑马鱼突变体中仅含95个氨基酸。

11、在优选的实施方案中，fgf21基因缺失斑马鱼的构建过程包含如下步骤：

12、1)根据crispr/cas9，在fgf21基因第3外显子确定了fgf21基因的靶点，序列为5’ggagctgcgttcagtcaaag3’，在靶点序列前端添加启动子序列，在靶点后端添加grna识别序列，合成fgf21-grna序列；

13、2)对fgf21-grna进行体外转录，提取纯化；

14、3)将纯化的fgf21-grna和cas9蛋白显微注射至斑马鱼一细胞期的胚胎，培养获得fgf21纯合子突变体。

15、进一步地，所述的fgf21纯合子突变体为f3代。

16、在优选的实施方案中，所述的幼鱼期延迟发育进度指胚盾期胚胎顶端距胚盾顶端距离增加、外包期外包减缓、体节期体节数量减少；成鱼期肝脏发育缺陷指肝脏发育缓慢、肝脏小。

17、本发明的第三方面，则公开了一种fgf21基因缺失斑马鱼在构建肝脏发育缺陷、早期发育迟缓的斑马鱼模型中的应用，所述的fgf21基因缺失斑马鱼突变体为肝脏发育缺陷或早期发育迟缓的斑马鱼模型，所述fgf21基因缺失斑马鱼是通过crispr/cas9靶向基因敲除斑马鱼fgf21基因的3号外显子第217号碱基a得到的。

18、本发明的第四方面是提供了前述的一种肝脏发育缺陷或早期发育迟缓的斑马鱼模型在药物筛选中的作用。

19、该斑马鱼模型还可作为肝脏再生缺陷模型。其呈现为，例如斑马鱼肝脏被部分切除后，再生过程中该斑马鱼模型的肝脏出现再生缓慢，明显小于正常斑马鱼肝脏被部分切除后的再生肝脏大小。

20、相对于现有技术，本发明具有的有益效果：本发明通过crispr/cas9技术成功敲除了斑马鱼的fgf21基因，并通过遗传筛选获得了能够稳定遗传的f3代纯合子突变体，且该模型具有成鱼期肝脏发育缺陷、幼鱼期发育迟缓等显著表型。表型可模拟人类疾病的病症，进而用于研究分子遗传病的病理机制、筛选治疗疾病的化学药、开发基因治疗的生物药，进行相关的毒理学研究等，可以作为临床上筛选治疗肝脏损伤(例如被部分切除)后再生缺陷、肝脏发育缺陷或早期发育迟缓的新的药物模型。

技术特征：

1.一种fgf21基因缺失斑马鱼的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.一种肝脏发育缺陷或早期发育迟缓的斑马鱼模型，其特征在于，所述的斑马鱼模型为fgf21基因缺失斑马鱼突变体，fgf21基因缺失斑马鱼突变体是通过crispr/cas9靶向基因敲除斑马鱼fgf21基因的3号外显子第217号碱基a得到的。

3.根据权利要求2所述的一种肝脏发育缺陷、早期发育迟缓的斑马鱼模型，其特征在于，所述的fgf21基因缺失斑马鱼突变体为fgf21纯合子，其表型为幼鱼期延迟发育进度、成鱼期肝脏发育缺陷。

4.根据权利要求2所述的一种肝脏发育缺陷、早期发育迟缓的斑马鱼模型，其特征在于，野生型fgf21蛋白含有194个氨基酸，而fgf21基因缺失斑马鱼突变体中仅含95个氨基酸。

5.根据权利要求2所述的一种肝脏发育缺陷、早期发育迟缓的斑马鱼模型，其特征在于，fgf21基因缺失斑马鱼突变体的构建过程包含如下步骤：

6.根据权利要求2所述的一种肝脏发育缺陷或早期发育迟缓的斑马鱼模型，其特征在于，所述的fgf21纯合子突变体为f3代。

7.根据权利要求2所述的一种肝脏发育缺陷或早期发育迟缓的斑马鱼模型，其特征在于，所述的幼鱼期延迟发育进度指胚盾期胚胎顶端距胚盾顶端距离增加、外包期外包减缓、体节期体节数量减少；成鱼期肝脏发育缺陷指肝脏发育缓慢、肝脏小。

8.一种fgf21基因缺失斑马鱼突变体在构建肝脏发育缺陷、早期发育迟缓的斑马鱼模型中的应用，其特征在于，所述的fgf21基因缺失斑马鱼突变体为肝脏发育缺陷或早期发育迟缓斑马鱼模型，所述fgf21基因缺失斑马鱼突变体是通过crispr/cas9靶向基因敲除斑马鱼fgf21基因的3号外显子第217号碱基a得到的。

9.权利要求2-7任意一项所述的一种肝脏发育缺陷或早期发育迟缓的斑马鱼模型在药物筛选中的作用。

技术总结本发明涉及一种FGF21基因缺失斑马鱼的构建方法及应用，属于动物模型领域。野生型斑马鱼中FGF21蛋白含有194个氨基酸，而FGF21基因缺失斑马鱼中仅含95个氨基酸。FGF21基因缺失斑马鱼表型为幼鱼期延迟发育进度、成鱼期肝脏发育缺陷。相对于现有技术，本发明通过CRISPR/Cas9技术成功敲除了斑马鱼的FGF21基因，并通过遗传筛选获得了能够稳定遗传的F3代纯合子突变体，表型可模拟人类疾病的病症，进而用于研究分子遗传病的病理机制、筛选治疗疾病的化学药、开发基因治疗的生物药。技术研发人员：强卫东,王雯雯,余胜男,吴书惠,张晓美,沈天柱,杨雷,龚方华,李校堃受保护的技术使用者：黄淮学院技术研发日：技术公布日：2024/6/18