一种基于氨基酸突变策略构建的具有超强α-糖苷酶抑制活性的新型白果源五肽的制作方法

本技术属于林源活性肽筛选制备领域，具体涉及一种基于氨基酸突变策略构建的具有超强α-糖苷酶抑制活性的新型白果源五肽。

背景技术：

1、 ii型糖尿病(t2dm)，作为不可治愈的慢性疾病，严重威胁人们的生命安全。如何预防和治疗t2dm已成为科研者关注的焦点。抑制α-glucosidase活性来阻碍餐后血糖的升高是临床上治疗t2dm的有效方法之一。多肽因其安全、高效和低毒性等优点近年来在治疗t2dm中受到广泛关注。

2、银杏作为世界上最古老的植物之一，其叶提取物的药用和保健价值一直受到人们的广泛关注[14-16]。但关于银杏种仁的研究却少有报道。目前，对于银杏种仁的利用还停留在食品加工的初级阶段[17-18]。这种低附加值的加工方式严重制约了银杏种仁的开发利用，导致每年大量的银杏种仁被丢弃，造成资源的严重浪费。因此，迫切需要开辟银杏种仁利用新途径，改变其高值化利用不足的现状。事实上，银杏种仁含有丰富的蛋白质（蛋白质含量约为 10%）。从银杏种仁中回收蛋白质并将其转化为 α-葡萄糖苷酶抑制肽，对于天然 α-葡萄糖苷酶抑制肽的开发和实现银杏种仁高值化利用具有重要意义。

3、然而，由于天然食源性多肽的生物活性通常较合成药物低，导致其不足以替代现有的人工合成药物（ye et al., 2022; fetse et al., 2023）。为进一步提高多肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性，有必要对现有多肽进行修饰。目前，多肽的修饰方法多聚焦于化学改性策略，如氨基酸取代、糖基化、环化等（sunde et al., 2021; wu et al., 2020; so etal., 2021）。其中，氨基酸取代因其操作简单、对肽段二级结构影响小等优点，被广泛应用于多肽的修饰（majura et al., 2022）。此外，前人研究表明，位于多肽n端的ser（s）、thr（t）、tyr（y）、lys（k）、arg（r）和/或位于c端的met（m）、ala（a）等氨基酸残基更倾向于在α-葡萄糖苷酶与肽之间形成氢键，从而有助于提高多肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性（ibrahim etal., 2018）。目前已从茶籽蛋白、核桃蛋白、马鹿茸蛋白、大豆分离蛋白、绿豆分离蛋白、乳清浓缩蛋白、巴旦木、小米等植物蛋白中分离出具有降血糖活性的多肽，但有关白果活性多肽的降血糖活性的研究鲜有报道。

技术实现思路

1、针对以上问题，本发明的目的在于提供一种基于氨基酸突变策略构建的具有超强α-糖苷酶抑制活性的新型白果源五肽。

2、本发明中的新型五肽化合物是从前期在银杏白果（ginkgo biloba l.）中提取获得的fapsw的基础上，经氨基酸突变策略，获得的结构新颖的具有药用价值的天然活性物质。并发现其能够有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，可应用于降糖药物或功能保健品的开发。

3、本发明的目的通过下述技术方案实现：

4、（1）基于与α-葡萄糖苷酶多肽之间形成氢键的策略构建

5、位于多肽n端的serine（s）、threonine（t）、tyrosine（y）、lysine（k）、arginine（r）和/或位于c端的methionine（m）、alanine（a）等氨基酸残基更倾向于与α-葡萄糖苷酶形成氢键，能够提高多肽的α-葡萄糖苷酶抑制活性

6、（2）固相合成活性多肽

7、参考母体fapsw的氨基酸序列，采用叔丁氧羰基（boc）作为氨基酸n端的保护基，再通过串联反应的方式将氨基酸逐一加入到多肽链中，然后通过去保护等一系列步骤完成合成系列多肽（yapsa、rapsa、kapsa、sapsa、vapsm、vapsw、fapsa、tapsa、tapsw、fapsm、vapsa、yapsw、kapsw、rapsm、sapsw、kapsm、sapsm、tapsm、rapsw、yapsm、fapsw）。

8、（3）白果多肽的序列结构解析

9、采用 ab eksigent ekspert™纳升液相色谱（lc 425）联用 sciex triple tof™5600 plus 质谱测定上述多肽的氨基酸序列。液相色谱条件：色谱柱：3c18-cl-120 色谱柱（0.3×150 mm, 3 μm）。流动相 a 为2%乙腈水溶液（含 0.1%甲酸，v/v），流动相 b 为 98%乙腈水溶液（含 0.1%甲酸，v/v）。梯度洗脱程序为：0-1 min，95% a -92% a；1-51 min，92%a-62% a；51-52 min, 62% a-20% a。流速为 0.30 μl/min。质谱条件：扫描模式为正离子模式。一级质谱扫描范围为 350~1250 m/z，二级质谱扫描范围为 100~1500 m/z。其他质谱检测器参数设置如下：气帘气：30 psi，30 l/min；离子喷雾电压：2.3 kv；去簇电压为 80 ev，ce 和 ces 分别为 40 ev 和 5 ev。

10、（4）活性多肽的筛选及突变构建

11、使用 peptideranker web 服务器（http://distilldeep.ucd.ie/peptideranker）对上述 alc ≥99%的多肽进行进一步筛选，评分大于 0.50 的多肽视为生物活性肽，选取这些潜在生物活性多肽进行下一步接分析。

12、（6）α-葡萄糖苷酶抑制活性肽的筛选

13、通过 pymol（教育版）生成多肽的三维结构，并使用 ligprep 模块中的 opls4 力场对其结构进行优化。α-葡萄糖苷酶晶体结构（pdb id: 3wy1）从 rcsb 蛋白数据库(https://www.rcsb.org/structure/3wy1)下载，并通过 maestro（schrödinger）软件中的protein preparation wizard 模块对蛋白结构进行去水、加氢以及补充缺失的原子，并利用 opls4 力场对其进行能量最小化处理。以原始配体位置附近定义结合位点，并使用额外精度（xp）对接模式（glide 程序）对蛋白和多肽进行对接。

14、2.根据权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶抑制活性的新型白果源五肽，其特征在于：所得的序列是通过peptideranker、pepsite 2和autodock 4.2，以及 gromacs（2022.2）筛选得到。

15、3. 根据权利要求1所述的α-葡萄糖苷酶抑制肽，具有α-葡萄糖苷酶抑制活性的白果源五肽，其特征在于，所述新型五肽的序列，是经n端突变构建了新型五肽yapsw（tyr-ala-pro-ser-trp），其α-糖苷酶抑制活性ic50 =126 μm。

16、有益效果

17、本发明首次从银杏白果蛋白的酶水解物中分离鉴定获得了一种氨基酸序列为fapsw，以及氨基酸突变构建的yapsw新型活性五肽，本发明提供的新型白果源活性五肽具有超强抑制α-葡萄糖苷酶活性的作用，其ic50分别为445 μm和126 μm，尤其是yapsw较阳性对照阿卡波糖（ic50=294 μm）抑制α-葡萄糖苷酶活性能力显著提高57%以上，可用于制备具备抑制α-葡萄糖苷酶活性功能的保健品或药品，为糖尿病的预防或治疗提供新的思路。

18、 说明书附图

19、图1 (a) yapsw与3wy1的3d结合模式图，(b) yapsw与3wy1相互作用的2d图

20、图2 (c) fapsw与3wy1的3d结合模式图，(d) fapsw与3wy1相互作用的2d关系图

21、图3 fapsw−3wy1和yapsw−3wy1复合物的回转半径图 (50-100 ns)

22、图4 yapsw质谱信息：（a）yapsw的一级质谱（b）yapsw的二级质谱