苞舌兰实时荧光定量PCR检测方法及检测试剂盒

本发明属于生物物种鉴定，具体涉及一种苞舌兰实时荧光定量pcr检测方法及检测试剂盒。

背景技术：

1、苞舌兰（ spathoglottis pubescen）隶属兰科兰亚科树兰族苞舌兰属，具有较高的园艺价值和保护生物学价值，为国家重点保护珍稀濒危植物。目前，国内外对物种资源的检测鉴定主要通过植物形态学进行观察分析，仅仅依靠形态学鉴定往往很难做出准确的检测，特别是在植物发育不完全或只有部分植株材料的时候。实时荧光定量pcr用于检测鉴定生物物种要符合特定引物探针设计要求，尤其要找到区别于其他近似种的特异引物和探针位点，探针选择不好会有假阳性扩增。目前没有苞舌兰的实时荧光定量pcr检测鉴定相关的专利文献和非专利文献公开。本发明针对濒危兰科植物苞舌兰进行鉴定区分。

2、苞舌兰实时荧光定量pcr检测方法研究需要对苞舌兰及其近似种进行形态学鉴定评价，然后通过深入序列测定、序列比较及基因信息分析，确定苞舌兰基因组序列特定片段作为分析鉴定的靶标。由于兰科植物种类繁多，地理分布较近的种类分子水平的差异较小，要找到区别于其他近似种的特异引物和探针位点难度很大，甚至不同引物的选择对同一探针的扩增效率有所影响。目前兰科植物检测鉴定主要通过常规pcr扩增检测，存在检测周期长、鉴定效率低、操作繁琐等问题。设计出具有特异性的taq-man实时荧光定量pcr引物和探针，是本领域亟需解决的技术难题。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种苞舌兰实时荧光定量pcr检测方法，该检测方法解决了苞舌兰近似种基因序列差异较小，苞舌兰特异片段定位困难，容易出现假阳性扩增的技术难题，从而快速准确地检测鉴定苞舌兰。

2、为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：一种苞舌兰实时荧光定量pcr检测方法，提取待检植物样品dna，利用引物和探针进行实时荧光定量pcr检测鉴定苞舌兰。

3、具体的，所述引物包含上游引物seq id no.1与下游引物seq id no.2，其序列为：

4、上游引物seq id no.1:5'-agcgggttatcgtcttctca-3'；

5、下游引物seq id no.2:5'-gcaagcacgagacaacatag-3'。

6、具体的，所述探针seq id no.3序列为：seq id no.3:5'-acaatgggtggatga-3'，荧光基团连接在探针的5'末端，淬灭基团连接在3'末端。所设计的探针5'端荧光报告基团标记为fam（羧基荧光素），探针3'端淬灭基团标记为mgb（minor groove binder，小沟结合物）。

7、具体的，所述实时荧光定量pcr检测的反应体系为25μl，包括2×premix ex taq（probe qpcr）12.5μl、上游引物seq id no.1（10μmol/l） 0.5μl、下游引物seq id no.2（10μmol/l）0.5μl、探针seq id no.3（10μmol/l）0.5μl、50×rox reference dye 0.5μl、dna模板2μl、ddh2o 8.5μl。

8、具体的，所述实时荧光定量pcr检测方法的反应程序包括：预变性95℃10min；95℃15sec，60℃1min，循环40次。

9、本发明还提供了一种用于实时荧光定量pcr检测苞舌兰的试剂盒，该检测试剂盒包括：上游引物seq id no.1，下游引物seq id no.2，探针seq id no.3。

10、具体的，所述上游引物seq id no.1序列为：5'-agcgggttatcgtcttctca-3'；

11、所述下游引物seq id no.2序列为：5'-gcaagcacgagacaacatag-3'；

12、所述探针seq id no.3序列为：5'-acaatgggtggatga-3'，荧光基团连接在探针的5'末端，淬灭基团连接在3'末端。

13、通过实施本发明的技术方案，可以达到以下有益效果：

14、（1）通过测定兰科植物的基因组序列，序列比对分析苞舌兰及其近似种的差异位点，根据苞舌兰核糖体基因序列的特异靶标序列设计特异性引物和探针，可以有效地区分苞舌兰及其近似种。

15、（2）可实现在核酸浓度较低的情况下对苞舌兰的检测，检测的最低dna浓度可达1×10﹣2 ng/μl。

16、（3）可实现用一对引物、一个探针在一个反应内对苞舌兰实施快速、精准地鉴定溯源，且扩增效率高，解决了容易出现假阳性扩增的技术难题。

技术特征：

1.一种苞舌兰的实时荧光定量pcr检测方法，其特征在于，提取待检植物样品dna，利用引物和探针进行实时荧光定量pcr检测鉴定苞舌兰；

2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，实时荧光定量pcr检测反应体系为25μl，包括2×premix ex taq（probe qpcr）12.5μl、上游引物seq id no.1 0.5μl、下游引物seq id no.2 0.5μl、探针seq id no.3 0.5μl、50×rox reference dye 0.5μl、dna模板2μl、ddh2o 8.5μl。

3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述实时荧光定量pcr检测反应程序包括：预变性95℃10min；95℃15sec，60℃1min，循环40次。

4.权利要求1-3任一项所述的检测方法在苞舌兰检测中的应用。

5.一种苞舌兰的实时荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，该检测试剂盒包括：上游引物seq id no.1，下游引物seq id no.2，探针seq id no.3。

6.根据权利要求5所述的实时荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，所述引物的序列为：

7.根据权利要求5所述的实时荧光定量pcr检测试剂盒，其特征在于，所述探针的序列为：seq id no.3:5'-acaatgggtggatga-3'，荧光基团连接在探针的5'末端，淬灭基团连接在3'末端。

8.权利要求5-7任一项所述的试剂盒在苞舌兰检测中的应用。

技术总结本发明提供了一种苞舌兰实时荧光定量PCR检测方法及检测试剂盒，根据苞舌兰核糖体基因序列的特异靶标序列设计特异性引物（SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2）和探针（SEQ ID NO.3），建立了苞舌兰实时荧光定量PCR检测方法及检测用引物和探针，以达到快速准确检测鉴定苞舌兰。本发明方法特异性强，鉴定结果直观，弥补了形态学鉴定方法的不足。技术研发人员：吴华,潘英文受保护的技术使用者：海南医学院技术研发日：技术公布日：2024/6/18