与小麦籽粒过氧化物酶活性相关的分子标记及所用引物组合物与应用

本发明属于生物，具体涉及一种与小麦籽粒过氧化物酶活性相关的分子标记及所用引物组合物与应用。

背景技术：

1、小麦是全球第一大粮食作物，也是我国的主要口粮作物。不同传统食品如面条、饺子、馒头等对小麦面粉品质具有不同的要求，品质改良已成为小麦产业竞争力的重要因素。小麦籽粒中过氧化物酶(peroxidase，pod)对改善小麦面粉色泽及面制品营养品质中起到重要作用，过氧化物酶活性越高，小麦面粉的颜色越白。小麦籽粒中的pod具有氧化和还原双重作用，不仅能催化阿魏酸等主要酚酸的氧化，并产生发色集团(如醌式结构)，形成褐色物质，使面粉在加工储藏过程中发生褐变，还有与lox类似的作用，在面团混合过程中其催化形成的产物能在面团烘烤过程中部分被破坏形成挥发物如正己醛，可增加面包的香气，是影响面包、馒头等面制品白度的重要因素。用pod处理面团时，由于处理后面团成分的变化，其中纯化的阿拉伯木聚糖分子量的增加可能是一个因素，可以显著增加面团品质的弹性、硬度和面包体积并降低粘性等特性，从而改善面团的特性。

2、通过遗传途径改良我国小麦加工品质是一种有效途径，而育种上突破性的成就取决于关键基因的发掘和利用。面粉中谷蛋白和醇溶蛋白的组成和含量、过氧化物酶活性、脂肪氧化酶活性、籽粒多酚氧化酶等均影响着小麦面粉的白度，并最终决定面粉的品质。过氧化物酶存在与lox类似的对胡萝卜素的漂白活性，它能催化羧基、酮基的化合物与酚类、芳香族等不饱和双键释放出分子氧进而将面制品中色素分子的共轭双键氧化为单键，对面粉起到漂白作用，从而影响面粉的色泽。因其与lox相比，具有较少破坏面制品风味的特性，从而取代lox作为主要的食品添加剂。pod活性是由多基因控制的复杂数量性状，受环境影响大，直接对pod活性高低进行选择难度较大，利用分子标记聚合pod活性相关基因，是进行pod活性改良的重要途径。功能标记是根据功能基因内部引起表型性状变异的多态性序列开发出来的一种新型分子标记，由于来自基因内的功能性基序，从理论上来讲此类标记不需要进一步验证就可以在不同的遗传背景下确定目标等位基因的有无，且目前可用功能标记较少。因此，发掘小麦pod活性相关基因，开发基因特异性分子标记，是进行基因聚合育种和品质性状分子机理研究的重要基础，对培育具有优良品质的小麦新品种，具有重要的理论与现实意义。

3、小麦籽粒pod活性主要受基因型影响，主效qtl挖掘的研究尚不深入。虽然环境因素对pod活性有一定影响，但pod活性主要受遗传因素影响。有关小麦品种间pod活性变异及主效位点挖掘的研究相对较少。在禾本科作物中，普通小麦具有最高的pod活性，分别是燕麦、水稻和玉米的3倍、6倍和7倍。普通小麦pod活性显著高于(p<0.05)硬粒小麦。在普通小麦的不同品种间pod活性可相差3-10倍。因此通过遗传途径改变pod活性是可行的。brenchley r等研究发现普通小麦染色体组成复杂，过氧化物酶基因种类多，分布广，在整个小麦a，b，d中都有分布。目前参与高等植物pod生物合成的主要基因克隆已有报道，但对其调控机制尚未进行深入研究。为了更准确地鉴定小麦品种pod活性的基因型，有必要对重要主效位点基因克隆，并根据该基因位点不同等位基因的序列开发共分离的功能标记，进一步提高分子标记选择的准确性和育种效率为改良小麦pod活性提供有效的分子标记，最终为分子标记辅助育种及该基因的图位克隆奠定基础。

技术实现思路

1、本发明所要解决的主要技术问题是如何鉴定或辅助鉴定小麦籽粒的过氧化物酶活性。

2、为了解决上述问题，本发明提供了一种用于鉴定小麦籽粒pod活性的引物组合物。

3、本发明提供的用于鉴定小麦籽粒pod活性的引物组合物，由引物对1和引物对2组成；

4、所述引物对1为如下(a1)-(a3)中任一所示的引物对：

5、(a1)由seq id no.1所示的单链dna和seq id no.2所示的单链dna组成的引物对；

6、(a2)由将seq id no.1和seq id no.2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链dna分子组成的，且与(a1)中所述引物对功能相同的引物对；

7、(a3)由经seq id no.5所示核苷酸序列设计所得的引物对，且与(a1)中所述引物对功能相同的引物对；

8、所述引物对2为如下(b1)-(b3)中任一所示的引物对：

9、(b1)由seq id no.3所示的单链dna和seq id no.4所示的单链dna组成的引物对；

10、(b2)由将seq id no.3和seq id no.4经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后所得序列所示的两条单链dna分子组成的，且与(b1)中所述引物对功能相同的引物对；

11、(b3)由经seq id no.6所示核苷酸序列设计所得的引物对，且与(b1)中所述引物对功能相同的引物对。

12、所述引物对1的pcr扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、67℃复性30s、72℃延伸45s，共35个循环；最后72℃延伸8min；4℃保温。将得到的pcr扩增产物分别进行测序。

13、所述引物对2的pcr扩增的反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s、62℃复性30s、72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸8min；4℃保温。将得到的pcr扩增产物分别进行测序。

14、扩增产物经1.0％的琼脂糖凝胶、1×tae电泳缓冲液体系电泳后，进行溴化乙锭染色。

15、本发明还提供了一种用于鉴定小麦籽粒pod活性的pcr试剂或含有所述pcr试剂的试剂盒，所述pcr试剂为由pcr试剂1和pcr试剂2组成的引物组合物；或所述pcr试剂为pcr试剂1或pcr试剂2。

16、所述pcr试剂1包括前文所述引物组合物中的所述引物对1；

17、所述pcr试剂2包括前文所述引物组合物中的所述引物对2。

18、本发明还提供了前文所述的引物组合物或所述的pcr试剂或所述试剂盒在如下任一中的应用：

19、(1)鉴定或辅助鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性；

20、(2)小麦育种；

21、(3)制备鉴定或辅助鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的产品；

22、(4)制备小麦育种的产品。

23、本发明还提供了检测待测小麦籽粒基因组中tapod-7as分子标记的基因型的物质在如下中应用：

24、(1)鉴定或辅助鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性；

25、(2)小麦育种；

26、(3)制备鉴定或辅助鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的产品；

27、(4)制备小麦育种的产品。

28、上述应用中，所述tapod-7as分子标记的基因型为tapod-7asa或tapod-7asb，所述基因型tapod-7asa的小麦是采用前文所述的引物组合物或前文所述的pcr试剂或所述试剂盒扩增小麦基因组得到的pcr产物满足如下条件：所述引物对1的pcr扩增产物含有大小为424bp的片段，且所述引物对2的pcr扩增产物不含有大小为464bp的片段，则小麦tapod-7as分子标记的基因型为tapod-7asa。

29、上述应用中，所述基因型tapod-7asb的小麦是采用前文所述的引物组合物或前文所述的pcr试剂或所述试剂盒扩增小麦基因组得到的pcr产物满足如下条件：若所述引物对2的pcr扩增产物含有大小为464bp的片段，且所述引物对1的pcr扩增产物不含有大小为424bp的片段，则小麦tapod-7as分子标记的基因型为tapod-7asb。

30、上述应用中，所述检测待测小麦籽粒基因组中tapod-7as分子标记的基因型的物质为前文所述的引物组合物或前文所述的pcr试剂或所述试剂盒。

31、本发明还提供了一种鉴定或辅助鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的方法，包括检测待测小麦籽粒基因组中tapod-7as分子标记的基因型，所述tapod-7as分子标记的基因型为tapod-7asa或tapod-7asb。

32、上述方法中，所述基因型为tapod-7asa的小麦是采用前文所述的引物组合物或前文所述的pcr试剂或所述试剂盒扩增小麦基因组得到的pcr产物满足如下条件：所述引物对1的pcr扩增产物含有大小为424bp的片段，且所述引物对2的pcr扩增产物不含有大小为464bp的片段，则小麦tapod-7as分子标记的基因型为tapod-7asa。

33、上述方法中，所述基因型为tapod-7asb的小麦是采用前文所述的引物组合物或前文所述的pcr试剂或所述试剂盒扩增小麦基因组得到的pcr产物满足如下条件：若所述引物对2的pcr扩增产物含有大小为464bp的片段，且所述引物对1的pcr扩增产物不含有大小为424bp的片段，则小麦tapod-7as分子标记的基因型为tapod-7asb。

34、小麦籽粒基因组中tapod-7as分子标记的基因型tapod-7asb的待鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性高于或候选高于基因型tapod-7asa的待鉴定小麦。

35、本发明还提供了小麦育种的方法，所述方法包括检测小麦基因组中前文所述tapod-7as分子标记的基因型，所述tapod-7as分子标记的基因型为tapod-7asa或tapod-7asb，选择所述tapod-7as分子标记的基因型为tapod-7asb的小麦作为亲本进行育种，所述基因型为tapod-7asb的小麦是采用前文所述的引物组合物或前文所述的pcr试剂或所述试剂盒扩增小麦基因组得到的pcr产物满足如下条件：所述引物对2的pcr扩增产物含有大小为464bp的片段，且所述引物对1的pcr扩增产物不含有大小为424bp的片段，则待测小麦的基因型为tapod-7asb。

36、本发明中，所述育种的目的是选育小麦籽粒过氧化物酶活性高的小麦种质。

37、本发明还提供了产品，所述产品含有前文中所述引物组合物，所述产品为任一种：

38、(1)鉴定或辅助鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的产品；

39、(2)制备鉴定或辅助鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的产品；

40、(3)用于小麦育种的产品。

41、本发明还提供了dna分子，所述dna分子的核苷酸序列是seq id no.5或者seq idno.6。

42、本发明还提供了前文所述的dna分子在如下中应用：

43、(1)鉴定或辅助鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性；

44、(2)小麦育种；

45、(3)制备鉴定或辅助鉴定小麦籽粒过氧化物酶活性的产品；

46、(4)制备小麦育种的产品。

47、在本发明中，所述pod活性均表示过氧化物酶活性。

48、本发明中，当pod活性小于等于6.68×102u.g-1.min-1时，表明该小麦为籽粒过氧化物酶活性低的小麦；当pod活性大于等于6.68×102u.g-1.min-1时，表明该小麦为籽粒过氧化物酶活性高的小麦。

49、在本发明中，采用前文所述的引物组合物或前文所述的pcr试剂或所述试剂盒扩增小麦基因组得到的pcr产物满足如下条件：

50、(1)若引物对1的pcr扩增产物含有大小为424bp的片段，和/或引物对2的pcr扩增产物不含有大小为464bp的片段，则待测小麦为低pod活性小麦；

51、若所述引物对2的pcr扩增产物含有大小为464bp的片段，和/或所述引物对1的pcr扩增产物不含有大小为424bp的片段，则待测小麦为高pod活性小麦。

52、(2)若引物对1的pcr扩增产物含有大小为424bp的片段，和/或引物对2的pcr扩增产物不含有大小为464bp的片段，则待测小麦携带等位基因tapod-7asa；

53、若所述引物对2的pcr扩增产物含有大小为464bp的片段，和/或所述引物对1的pcr扩增产物不含有大小为424bp的片段，则待测小麦携带等位基因tapod-7asb。

54、其中，所述大小为424bp的片段为seq id no.5的第250-790位；所述大小为464bp的片段为seq id no.6的第398-788位。

55、在本发明中，小麦的pod活性通过小麦籽粒的pod活性体现，即小麦pod活性为小麦籽粒的pod活性。

56、本发明依据等位基因序列差异开发简便低廉的功能标记，是dna标记开发的新方向和重点。进一步针对小麦pod活性开发具有自主知识产权的基因功能标记，将小麦pod活性的影响因素进行深入研究，以推进pod活性的遗传改良。