一种三维聚焦声场调控的细胞包裹水凝胶微球制备方法及装置

本发明涉及微流控，特别涉及一种三维聚焦声场调控的细胞包裹水凝胶微球制备方法及装置。

背景技术：

1、进行单细胞研究是从细胞出发，揭示生命活动本质和探究重大疾病起因的必经之路。将细胞包裹在微环境中离散化是进行细胞研究的基本前提，而微液滴作为理想的微环境，被广泛用于细胞包裹。为了更真实的模拟细胞所处的生物环境，制备包裹细胞的水凝胶微球是理想的手段。水凝胶微球由于出色的多孔结构和良好的生物相容性，可用于细胞和蛋白质包埋、药物释放控制、高通量dna测序、生物传感和荧光示踪剂等。将细胞封装于凝胶微球中，可以避免多细胞之间的相互干扰，保证细胞研究所需要的生物环境，避免外界污染，更易进行单细胞分析。

2、目前国内外学者从细胞的预排列和液滴生成控制方面，开展了大量的微液滴单细胞包裹的研究。目前单细胞包裹主要分为被动式微流控包裹方法(collins d j,neild a,demello a,et al.the poisson distribution and beyond:methods for microfluidicdroplet production and single cell encapsulation[j].lab on a chip,2015,15(17):3439–3459；kamalakshakurup g,lee a p.high-efficiency single cellencapsulation and size selective capture of cells in picoliter droplets basedon hydrodynamic micro-vortices[j].lab on a chip,2017,17:4324–4333；sauzade m,brouzes e.deterministic trapping,encapsulation and retrieval of single-cells[j].lab on a chip,2017,17(13):2186–2192)以及主动式微流控包裹方法(shojaeian m,hardt s.fast electric control of the droplet size in a microfluidic t-junction droplet generator[j].applied physics letters,2018,112:194102；chen i,tsai h,chang c,etal.electric-field triggered,on-demand formation of sub-femtoliter droplets[j].sensors&actuators:b.chemical,2018,260:541–553；zhang q,li h,zhu c,et al.micro-magnetofluidics of ferrofluid droplet formation in at-junction[j].colloids and surfaces a:physicochemical and engineeringaspects,2018,537:572–579)。被动式微流控包裹方法依靠流道结构调节细胞包裹，难以克服悬浮细胞的随机性，包裹效率较低；主动式包裹方法，通过电学参数调控液滴生成的大小和速率来调整包裹细胞的个数的研究较多，但电场调控所需的直流或交流电压均需达到上千幅度，往往会对细胞造成损伤。

3、在与外力结合的外力场微流控技术中，声表面波越来越多地被用于各种生物粒子的精确操控。1-1000mhz声表面波装置已经实现了对微液滴、微粒、细胞等的单排排列的精确操控。鉴于声表面波高效的流固耦合性、非接触、较好的生物兼容性等优点，声学方法被认为是处理生物样品理想的方法，为微液滴系统中细胞包裹过程中的精准有序排列提供了新的思路和可能性。

技术实现思路

1、为了克服上述技术方法的不足，促进细胞包裹技术的发展，本发明的目的在于提供一种三维聚焦声场调控的细胞包裹水凝胶微球制备方法及装置。采用三维螺旋流道结构的微流控立体喷头结构，实现对悬浮细胞的单排排列和距离调控；集成三维锥形叉指换能器激发的三维聚焦声场，通过声-固-液多物理场耦合，对液滴生成界面的振动作用，促进液滴更容易在凝胶微球打印出口断裂生成，然后依靠微液滴的生成过程实现单细胞的精准包裹，通过调整正弦交流电压参数值，细胞包裹液滴大小可调，可实现对包裹细胞数量的有效控制。

2、为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种用于制备细胞包裹水凝胶微球的三维聚焦声场调控装置,所述装置包括底座，所述底座由四个铝型材通过螺栓连接组成，其中两个相对的铝型材之间固定安装有两根第一滑杆，y轴移动平台与第一滑杆滑动连接，y轴移动平台可以沿着第一滑杆往复移动，实现y方向移动；另外两个相对的铝型材上表面各固定安装有一根支撑臂，两根支撑臂的顶端通过上支撑臂固定连接在一起，每个支撑臂的侧面均固定安装有一根第二滑杆，第二滑杆与支撑臂平行设置；连接板的两端均与第二滑杆滑动连接，连接板可以沿第二滑杆上下移动，实现z方向的移动。

4、所述的连接板上开设有滑槽，喷头夹具滑动安装在滑槽上，喷头通过螺栓固定安装在喷头夹具上，喷头夹具可以沿着滑槽往复移动，从而实现喷头的x方向的移动。

5、进一步地，还包括显微观察装置，所述的显微观察装置包括第一构件，所述第一构件固定安装在上支撑臂上，第二构件的一端与第一构件转动连接，第三构件的一端与第二构件的另一端转动连接，第四构件的一端与第三构件的另一端转动连接，第五构件的一端与第四构件的另一端转动连接，第六构件的一端与第五构件的另一端转动连接，相机外壳底座一端通过螺栓与第六构件的另一端连接，高速相机通过相机外壳固定安装在相机外壳底座的另一端，高速相机前端安装显微镜筒；显微镜筒可实现对细胞和微液滴图像的放大，与高速相机配合便于用户观察，显微观察装置用以对细胞排列和液滴生成过程进行观察。

6、进一步地，所述喷头由圆环段，圆柱段和圆锥段组成，其中，圆柱段和圆锥段一体设置，圆柱段的上方通过圆环段固定在喷头夹具上；圆柱段和圆锥段上开设有三维流道结构，三维流道结构由溶液入口、三维螺旋流道、直流道、第一鞘液入口、第二鞘液入口、聚焦同轴流道和凝胶微球打印出口构成，用于流体和细胞的操控。

7、进一步地，在圆锥段的外侧固定安装有三维锥形叉指换能器，三维锥形叉指换能器由压电基底、第一弧形电极、第二弧形电极、第三弧形电极和第四弧形电极组成。

8、进一步地，三维螺旋流道、直流道截面为圆形，圆形直径均为100微米；聚焦同轴流道截面为圆形，圆形直径为200微米；通过在三维流道结构锥形面外侧溅射氧化锌(zno)形成压电基底；压电基底上设置有第一弧形电极、第二弧形电极、第三弧形电极和第四弧形电极,电极的材质均为cr-au；三维锥形叉指换能器与直流道同轴；三维螺旋流道用于悬浮细胞的单排排列；聚焦同轴流道用于单排细胞相邻细胞间距的调控。

9、进一步地，喷头的三维锥形叉指换能器部分材质为光敏树脂，通过3d打印或激光加工的方式一体化制作。

10、三维聚焦声场调控的细胞包裹水凝胶微球制备方法，包括以下步骤：

11、1)通过控制器控制y轴移动平台、连接板和喷头夹具移动到合适位置，培养皿或载有有机溶液的医用多孔板放置在y轴移动平台上，凝胶微球打印出口正对培养皿或者多孔板，培养皿或者多孔板载有有机溶液，将培养皿或多孔板置于365nmuv紫外灯下；将显微观察装置的视野对准喷头中的三维流道结构；

12、2)通过特氟龙软管将载有悬浮细胞的水凝胶聚合物溶液a的注射器a与溶液入口进行连接，将载有鞘液b的注射器b与第一鞘液入口进行连接，将载有鞘液b的注射器c与第二鞘液入口进行连接，并将注射器a、注射器b和注射器c分别固定于注射泵a、注射泵b和注射泵c上；

13、3)开启注射泵a、注射泵b和注射泵c，在注射泵的驱动下，水凝胶聚合物溶液a经溶液入口，进入并充满三维螺旋流道和直流道；三维螺旋流道产生的迪恩力驱动水凝胶聚合物溶液a的悬浮细胞，使得悬浮细胞在流道内单排有序排列，单排有序排列的细胞经过三维螺旋流道流入直流道；通过显微观察装置观察，持续调节注射泵b和注射泵c，使驱动鞘液b进入第一鞘液入口和第二鞘液入口；待水凝胶聚合物溶液a中的悬浮细胞在三维螺旋流道和直流道中单排有序排列后，在聚焦同轴流道处，鞘液b与水凝胶聚合物溶液a形成聚焦同轴流，且水凝胶聚合物溶液a被挤压在鞘液b中心，调节鞘液b的流速，对细胞间距进行调节，然后在凝胶微球打印出口处生成细胞包裹液滴；

14、4)将声表面波信号发生器的输出信号的正极连接第一弧形电极、第三弧形电极，负极连接第二弧形电极、第四弧形电极，调节信号发生器的输出信号为正弦连续输出；

15、5)按下声表面波信号发生器的“输出”按钮，并设定相应的正弦交流电压输出值，三维锥形叉指换能器在交流电压信号的激励下产生声表面波，声表面波在凝胶微球打印出口10-7处聚焦增强，通过调整正弦交流电压参数值，在聚焦声场对液滴生成界面振动的作用下，细胞包裹液滴大小可调，可实现对包裹细胞数量的有效控制；

16、6)通过对喷头在x、y轴方向的运动进行控制，包裹有细胞的水凝胶微液滴精准的滴入培养皿或多孔板；

17、7)打开365nmuv紫外灯，包裹有细胞的水凝胶微液滴发生交联反应，生成不同规格的细胞凝胶微球。

18、进一步地，所述水凝胶聚合物溶液a由质量分数35％(w/w)聚乙二醇二丙烯酸酯(peg-da，mn＝700da，35％wt，sigma)，1％(w/w)光引发剂(irgacure 651，basf)，2％(w/w)表面活性剂吐温80(sigma)和62％(w/w)去离子水的混合物组成，并将分散处理好的细胞悬浮其中；鞘液b由质量分数35％(w/w)聚乙二醇二丙烯酸酯(peg-da，mn＝700da，35％wt，sigma)，1％(w/w)光引发剂(irgacure 651，basf)，2％(w/w)表面活性剂吐温80(sigma)和62％(w/w)去离子水的混合物组成。

19、相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

20、(1)本发明采用三维螺旋流道和聚焦同轴流道结构的微流控立体喷头结构，三维螺旋流道产生的迪恩力驱动悬浮细胞单排排列，聚焦同轴流道可调控细胞间距。

21、(2)本发明采用三维锥形叉指换能器激发的三维聚焦声场，促进液滴更容易在凝胶微球打印出口断裂生成，通过调整正弦交流电压参数值，细胞包裹液滴大小可调，可实现对包裹细胞数量的有效控制。

22、(3)本发明中三维流道结构可通过3d打印或激光加工的方式一体化制作，加工简单，使用方便。

23、(4)本发明通过对细胞包裹水凝胶制备喷头在三维方向的运动控制，包裹有细胞的水凝胶微液滴可实现精准的定位供给。