一种来源于腺苷脱氨酶的胞嘧啶碱基编辑系统

本发明属于基因工程，具体涉及一种来源于腺苷脱氨酶的胞嘧啶碱基编辑系统。

背景技术：

1、crispr-cas技术是一项广泛应用的基因编辑技术，通过rna引导实现对基因组上特定靶序列的特异性结合并切割dna，形成双链断裂，然后利用生物非同源末端连接或同源重组进行定点基因编辑。

2、单碱基编辑工具的开发使得在不引起dna双链断裂的情况下能够对特定基因位点进行精确修饰，其基本原理是将胞苷脱氨酶或腺苷脱氨酶与cas蛋白融合，依赖于crispr原理实现对靶点的单个碱基的修改。单碱基编辑系统中，碱基编辑器主要由两个部分组成：cas蛋白和dna修饰酶，目前最主要的碱基编辑器有两类：基于胞苷脱氨酶的胞嘧啶碱基编辑器(cbe)，实现从c到t的转化；基于腺苷脱氨酶的腺嘌呤碱基编辑器(abe)，实现从a到g的转化。

3、已经报道的cbe系统包括：rapobec1、haid、pmcda1、hapobec3a和hapobec3b等，胞苷脱氨酶和cas蛋白相结合，可以实现从c到t碱基编辑，在此基础上加入一个或多个尿嘧啶dna糖基化酶抑制物(ugi)可以进一步提高从c到t碱基编辑的编辑效率和产物纯度。目前已经发现的胞嘧啶碱基编辑系统已经可以在特定位点进行有效的精准编辑，但有研究表明，rapobec1-cbe在小鼠胚胎和水稻植株中检测到全基因组的脱靶效应(zuo等，cytosinebase editor generates substantial off-target single-nucleotide variants inmouse embryos.2019，science)(jin等，cytosine,but not adenine,base editorsinduce genome-wide off-target mutations in rice.2019，science)。研究者们致力于寻找编辑效率更高、编辑特异性更优、普适性更好的胞嘧啶碱基编辑系统。

4、abe系统中的腺苷脱氨酶包括tada-7.10、tada-8e和tada-9，这些abe能够在人类细胞和植物中进行有效的从a到g碱基编辑。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了拓展植物中的cbe工具库，发掘具有更优编辑效率和编辑特异性的cbe编辑器。

2、本发明提供了一种tada-cda脱氨酶，具有胞苷脱氨酶作用；所述tada-cda脱氨酶的编码序列如seq id no.1所示。

3、本发明的技术方案是具备胞嘧啶碱基编辑功能的融合蛋白tadcbea，包括tada-cda脱氨酶与cas蛋白，结构为tada-cda脱氨酶-cas蛋白或cas蛋白-tada-cda脱氨酶；所述tada-cda脱氨酶为将具有腺苷脱氨酶作用的tada-8e改造为行使胞苷脱氨酶作用。

4、进一步的，所述tada-cda脱氨酶的编码序列如seq id no.1所示。

5、特别的，所述融合蛋白tadcbea的任一端还融合了1个或2个ugi。

6、具体的，所述融合蛋白tadcbea的编码序列如如seq id no.2第2065～6810位所示。

7、本发明还提供了来源于腺苷脱氨酶的胞嘧啶碱基编辑系统，包含tada-cda脱氨酶与cas蛋白融合构建成的融合蛋白tadcbea，融合蛋白tadcbea的结构为tada-cda脱氨酶-cas蛋白或cas蛋白-tada-cda脱氨酶；所述tada-cda脱氨酶为将具有腺苷脱氨酶活性的tada-8e改造为行使胞苷脱氨酶作用。

8、进一步的，所述tada-cda脱氨酶的编码序列如seq id no.1所示。

9、特别的，所述tadcbea的结构为tada-cda-cas-2×ugi。

10、进一步的，所述tadcbea的结构为启动子tada-cda-cas-2×ugi-终止子。

11、进一步的，所述启动子、tada-cda、cas、2×ugi和终止子相互之间还设有nls。

12、其中，所述cas为cas9、cas12a或cas12b。

13、具体的，所述cas9为ncas9。

14、其中，所述胞嘧啶碱基编辑系统还包括crrna转录表达单元。

15、具体的，胞嘧啶碱基编辑系统的结构为融合蛋白tadcbea-crrna转录表达单元或crrna转录表达单元-融合蛋白tadcbea。

16、进一步的，所述crrna转录表达单元结构为启动子-crrna scaffold-终止子。

17、特别的，所述启动子为osubi1、zmubi1或p35s。

18、其中，所述终止子为pinii、athsp、nos或t35s。

19、优选的，所述融合蛋白tadcbea-crrna转录表达单元的核苷酸序列如seq id no.2所示。

20、本发明还提供了表达所述tada-cda脱氨酶或融合蛋白tadcbea的载体、细胞或宿主。

21、进一步的，所述载体为植物表达载体。

22、本发明还提供了含有所述胞嘧啶碱基编辑系统的载体、细胞或宿主。

23、进一步的，所述载体为植物表达载体。

24、本发明的有益效果：本发明对腺苷脱氨酶tada-8e进行工程化改造，将本身具有腺苷脱氨酶作用的tada-8e改造为行使胞苷脱氨酶作用的tada-cda。tada-cda脱氨酶与cas蛋白融合构建成胞嘧啶碱基编辑器tadcbea，与融合腺苷脱氨酶tada-8e的腺嘌呤碱基编辑器abe8e行使从a到g的碱基编辑作用不同，tadcbea能够实现从c到t的碱基编辑功能。脱氨酶的作用核苷酸由腺苷a转变为胞苷c，但其编辑窗口和编辑特异性未发生变化，也就是说tadcbea具有与abe8e相同的编辑窗口和高编辑特异性。与目前最主流的的胞嘧啶碱基编辑器a3a_y130f-cbe相比，在水稻细胞中tadcbea的从c到t编辑效率与其相当，同时在水稻基因组和转录组中均未检测到tadcbea引起的脱靶效应，较a3a_y130f-cbe来说具有更高的编辑特异性，是一种高活性、高特异性的胞嘧啶碱基编辑工具。tada-cda的蛋白分子量为166个氨基酸，与a3a_y130f的199个氨基酸相比蛋白更小，有利于表达载体向目标物种的递送及后续编辑事件的发生。tadcbea能够实现有效的从c到t的碱基编辑并且在全基因组dna水平和转录组rna水平上几乎检测不到脱靶编辑。本发明提供的tadcbea拓展了植物的碱基编辑工具库，在植物种质资源开发和基因功能研究方面具有很好的应用前景。tadcbea的应用将为基础生物学和医学研究提供更多选择。

技术特征：

1.一种tada-cda脱氨酶，其特征在于：具有脱氨酶作用；所述tada-cda脱氨酶的编码序列如seq id no.1所示。

2.具备胞嘧啶碱基编辑功能的融合蛋白tadcbea，其特征在于：包括tada-cda脱氨酶与cas蛋白，结构为tada-cda脱氨酶-cas蛋白或cas蛋白-tada-cda脱氨酶；所述tada-cda脱氨酶的编码序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求2所述融合蛋白tadcbea，其特征在于：所述融合蛋白tadcbea的任一端还融合了1个或2个ugi。

4.根据权利要求2所述融合蛋白tadcbea，其特征在于：所述融合蛋白tadcbea的编码序列如seq id no.2第2065～6810位所示。

5.一种来源于腺苷脱氨酶的胞嘧啶碱基编辑系统，其特征在于：包含tada-cda脱氨酶与cas蛋白融合构建成的融合蛋白tadcbea，融合蛋白tadcbea结构为tada-cda脱氨酶-cas蛋白或cas蛋白-tada-cda脱氨酶；所述tada-cda脱氨酶的编码序列如seq id no.1所示。

6.根据权利要求5所述胞嘧啶碱基编辑系统，其特征在于：所述tadcbea的结构为tada-cda-cas-2×ugi。

7.根据权利要求6所述胞嘧啶碱基编辑系统，其特征在于：具有如下特征中的一个或多个：

8.根据权利要求7所述胞嘧啶碱基编辑系统，其特征在于：具有如下特征中的一个或多个：

9.根据权利要求7或8所述胞嘧啶碱基编辑系统，其特征在于：所述启动子为osubi1、zmubi1或p35s；所述终止子为pinii、athsp、nos或t35s。

10.根据权利要求9所述胞嘧啶碱基编辑系统，其特征在于：融合蛋白tadcbea-crrna转录表达单元的核苷酸序列如seq id no.2所示。

11.表达权利要求1所述tada-cda脱氨酶、权利要求2～4任一项所述融合蛋白tadcbea或含有权利要求5～10任一项所述胞嘧啶碱基编辑系统的载体、细胞或宿主。

12.根据权利要求11所述载体、细胞或宿主，其特征在于：所述载体为植物表达载体。

技术总结本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种来源于腺苷脱氨酶的胞嘧啶碱基编辑系统。本发明的目的是为了拓展植物中的CBE工具库，发掘具有更优编辑效率和编辑特异性的CBE编辑器。本发明的技术方案是具备胞嘧啶碱基编辑功能的融合蛋白TadCBEa，包括TadA‑CDa脱氨酶与Cas蛋白；所述TadA‑CDa脱氨酶为将具有腺苷脱氨酶作用的TadA‑8e改造为行使胞苷脱氨酶作用。本发明还提供了来源于腺苷脱氨酶的胞嘧啶碱基编辑系统，包含TadA‑CDa脱氨酶与Cas蛋白融合构建成的融合蛋白TadCBEa。TadCBEa能够实现从C到T的碱基编辑功能，是一种高活性、高特异性的胞嘧啶碱基编辑工具。技术研发人员：唐旭,范婷婷,张勇,郑雪莲受保护的技术使用者：西南大学技术研发日：技术公布日：2024/6/18