SLC39A4在制备胆管癌诊断或预后评估产品中的应用

本发明涉及生物检测，涉及slc39a4作为胆管癌生物标志物的应用，具体涉及slc39a4在制备胆管癌诊断试剂或试剂盒，以及在制备治疗药物组合物中的应用。

背景技术：

1、胆管癌是一种由胆道上皮细胞异常分化和增殖引起的原发性恶性肿瘤，其中起源于肝实质内胆管的病变被称为肝内胆管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,icc)，发病率约占胆管癌的20％-30％。在临床上，icc的早期阶段没有症状或症状轻微、不典型，因此这些肿瘤通常在晚期才被确诊，此时已无法通过手术完全切除。目前，icc的治疗主要以手术为主，而对于无法手术的患者，辅助化疗、靶向治疗和局部治疗可延长生存期，但icc患者的5年生存率仍然很低。鉴于这类肿瘤的发病率在不断上升，icc的诊断和治疗成为世界性难题。因此，通过探究icc的分子发病机制来确定特定的治疗靶点寻找精确、有效的治疗药物和包括免疫疗法的个体化治疗方案，为这一毁灭性疾病的诊断和治疗提供了新的方向和希望。

2、slc39a4的基因id为55630，是编码锌/铁调节转运蛋白样蛋白(zip)家族的一个成员，编码的蛋白质定位于细胞膜。slc39a4通过zn(2+)单通道活性受锌供应的调节，在小肠对膳食锌的吸收中发挥重要作用，还能与cu(2+)、cd(2+)以及可能的ni(2+)进行多特异性结合和转运。相关研究表明，slc39a4在肿瘤的发生发展及耐药中具有重要的作用，包括：影响肿瘤发生发展(xia等，slc39a4 as anovel prognosis marker promotes tumorprogression in esophageal squamous cell carcinoma.onco targets ther.2020.13:3999-4008.)、肿瘤预后(zhou等，evaluation ofthe prognostic values ofsolutecarrier(slc)family 39genes for patients with lung adenocarcinoma.aging(albanyny).2021.13(4):5312-5331.)；调控肿瘤药物敏感性(liu等，zip4 increases expressionoftranscription factor zeb1 to promote integrinα3β1signaling and inhibitexpression of the gemcitabine transporter ent1 in pancreatic cancercells.gastroenterology.2020.158(3):679-692.e1)、肿瘤细胞增殖(li等，knockdownofslc39a4 expression inhibits the proliferation and motility ofgallbladdercancer cells and tumor formation in nude mice.cancer manag res.2021.13:2235-2246.)和肿瘤细胞迁移(wu等，slc39a4 expression is associated with enhanced cellmigration,cisplatin resistance,and poor survival in non-small cell lungcancer.sci rep.2017.7(1):7211.)等。然而，关于slc39a4在icc中的作用尚未见相关报道。那么，slc39a4在icc中表达水平是否存在异常，差异表达的slc39a4分子是否和icc的进展相关，其能否调控icc细胞的增殖、死亡和迁移能力等作用仍不清楚。

技术实现思路

1、本发明依托上述研究进行，目的在于提供胆管癌诊断以及预后的生物标志物，也在于提供slc39a4的新用途，即在制备胆管癌诊断试剂盒或治疗药物组合物中的应用。

2、本发明的研究过程如下：首先通过slc39a4的表达分析和生存分析，确定独立的预后因素，发现slc39a的高表达与胆管癌的不良预后相关，是胆管癌患者的独立预后因素。接下来，从胆管癌细胞株入手，通过抑制或沉默胆管癌细胞中slc39a4的表达，分析slc39a4的敲低效率，结果发现slc39a4在icc细胞中可以被特异性抑制或沉默。而后通过检测icc细胞的增殖、迁移和死亡能力，分析slc39a4在胆管癌精确诊断以及治疗方面的价值。由此，为icc提供有效的诊断、治疗及预后评估的分子。

3、具体地，本发明提供了如下技术方案：

4、本发明的第一方面，提供了slc39a4在制备胆管癌诊断或预后评估试剂或试剂盒中的应用。

5、通过slc39a4表达分析、slc39a4基因与胆管癌患者的预后相关分析，采用生存曲线来确定slc39a4的预后价值，确定slc39a4在胆管癌中显著上调，slc39a4的高表达与胆管癌的不良预后相关。

6、优选的，所述的slc39a4的基因id为55630，该基因编码锌/铁调节转运蛋白样蛋白(zip)家族的一个成员，预测在肿瘤的发生发展及耐药中具有重要的作用；所述的预后因素包括slc39a4表达程度和slc39a4在不同胆管癌患者中的生存价值。

7、优选的，所述胆管癌诊断或预后评估试剂为检测生物样品中slc39a4表达量的试剂；所述试剂盒包含了检测生物样品中slc39a4表达量的试剂。

8、进一步优选，所述的检测生物样品中slc39a4表达量的试剂选自qrt-pcr检测技术或方法中的物质，包含对slc39a4基因具有检测特异性的pcr引物，引物序列如seq id no.1～2所示，其对照物gapdh的引物序列如seq id no.3～4所示。通过该种方法可实现生物样本中slc39a4表达量的检测。

9、其中，生物样本选自患者的外周血或肿瘤组织。

10、本发明第二方面，提供了一种胆管癌诊断或预后评估试剂盒，包含了检测生物样品中slc39a4表达量的试剂。

11、具体的，该试剂盒是由逆转录系统、引物系统和扩增系统组成，所述的引物系统包括如下seq id no.1～4所示的pcr引物：

12、slc39a4-f引物：ggactttgtgttccagcagc(seq id no.1)；

13、slc39a4-r引物：cactcaggcataccgtgtcc(seq id no.2)；

14、gapdh-f引物：cttagcacccctggccaag(seq id no.3)；

15、gapdh-r引物：tggtcatgagtccttccacg(seq id no.4)。

16、本发明第三方面，提供了slc39a4抑制剂在制备治疗胆管癌药物中的应用。其中，所述slc39a4抑制剂选自如下任一种物质：降低slc39a4表达水平、降低slc39a4活性或促进slc39a4代谢的物质。

17、优选的，所述slc39a4抑制剂包括slc39a4的sgrna及crisper-cas9 mrna、sirna、短发夹rna、反义核苷酸中的任意一种，或携带上述任一种物质的纳米颗粒、病毒载体、peg修饰蛋白、蛋白微球、脂质体或细胞外囊泡，其中，所述sirna的序列如seq id no.5～10所示：

18、cauauggacugucggaacadtdt(seq id no.5)

19、uguuccgacaguccauaugdtdt(seq id no.6)

20、cuggucucuacguggcacudtdt(seq id no.7)

21、agugccacguagagaccagdtdt(seq id no.8)

22、gacuuaagaucccacaccudtdt(seq id no.9)

23、aggugugggaucuuaagucdtdt(seq id no.10)。

24、本发明具体实施方式中，通过将slc39a4 sirna导入肿瘤细胞，并通过qrt-pcr验证了敲低slc39a4的成功构建。

25、应理解，本文的slc39a4分子优选获自人，获自其它动物的与人slc39a4高度同源(如具有70％以上、75％以上、80％以上，更优选85％以上如85％、90％、95％、98％甚至99％或以上的序列相同性)的其它slc39a4分子也在本发明优选考虑的等同范围之内。比对序列相同性的方法和工具也是本领域周知的，如blast。

26、来源方面，本发明抑制剂选自：天然纯化物质、经修饰的天然纯化物质、半合成物质、化学合成物质；进一步的，所述抑制剂源自哺乳动物，如人、非人灵长类动物(例如猩猩、猿)、啮齿动物(例如大鼠、小鼠、豚鼠)、宠物(例如猫、狗)、家畜(例如马、牛、羊、猪、兔)。

27、本发明第四方面，提供了一种slc39a4抑制剂重组载体，包括表达载体以及插入设置在该表达载体上的slc39a4 sirna、shrna或反义核苷酸，其中sirna的序列如上述seq idno.5～10所示。

28、本发明第五方面，提供了上述slc39a4抑制剂重组载体在制备胆管癌治疗药物中的应用。

29、本发明第六方面，提供了一种胆管癌药物组合物，包括活性组分以及药学上可接受的辅料，其中，所述活性组分包括上述所述的slc39a4抑制剂或slc39a4抑制剂重组载体。

30、所述胆管癌药物组合物具有(1)-(4)中至少一种功能：

31、(1)诊断和/或防治胆管癌；

32、(2)抑制胆管癌细胞增殖；

33、(3)促进胆管癌细胞死亡；

34、(4)抑制胆管癌细胞迁移。

35、所述胆管癌细胞为hccc9810和rbe细胞。

36、进行治疗时，通过给予有需要的对象治疗有效量的slc39a4 sirna制剂或其重组表达载体制剂实现肿瘤治疗。优选，在给予本技术的slc39a4 sirna制剂之前、之时或之后给予其他抗肿瘤药物，以增强治疗效果。

37、本发明的给药方式多样，包括口服、注射(例如直接裸dna或蛋白质注射法、脂质体包裹dna、rna或蛋白质注射法)、金包被基因枪轰击法、繁殖缺陷细菌携带质粒dna法、复制缺陷腺病毒携带目的dna法或目的基因所编码蛋白质、电致孔、经静脉、肺部、黏膜、鼻腔、腹腔内、颅内、瘤内、舌下、颊部、透皮给药。

38、相比于现有技术，本发明的有益效果如下：

39、本发明首次公开了slc39a4在胆管癌诊断或预后评估中的应用，通过slc39a4在胆管癌中的表达和预后分析可知：slc39a4可作为胆管癌诊断、分期分级和预后评估的标志物。

40、本发明首次公开了抑制slc39a4在防治胆管癌中的应用，通过靶向下调slc39a4的表达，可以抑制胆管癌细胞的增殖和迁移能力，并且促进肿瘤细胞死亡，最终改善或治疗胆管癌。

41、就检测技术而言，slc39a4的检测本质上是一种基于血细胞基因表达状况的定量pcr检测，具有操作简便、检测灵敏、特异性好、重复性高等特点，现今已越来越多地被应用于临床检验技术中。本发明所采用基本检测方法是实时荧光定量pcr，这一技术的灵敏度、准确度都较高，临床上应用较广，试验技术已经十分成熟。

42、就效果而言，本发明所涉及的指标slc39a4在胆管癌患者肿瘤组织中特异性高表达，且差异具有统计学意义(p<0.05)，可作为胆管癌的诊断、转移和/或预后标志物；下调slc39a4可抑制胆管癌细胞的增殖、迁移，促进胆管癌细胞的死亡。因此其临床参考价值和可信度较高。