一种聚乙二醇衍生物的制备方法及其在药物长效化中的应用与流程

本发明涉及生物，特别是涉及一种聚乙二醇衍生物的制备方法，尤其涉及其重结晶方法及其在药物长效化中的应用。

背景技术：

1、聚乙二醇(peg)衍生物是一种聚醚类高分子材料，具有无毒、无免疫原性、无抗原性、生物相容性良好、价廉易得等优点。聚乙二醇衍生物能与药物通过共价键或非共价键方式进行偶联，在生物医药领域获得日益广泛的应用，尤其在提高蛋白及多肽药物稳定性、延长半衰期等方面，具有持续的研究热度和广阔的临床应用前景。

2、在蛋白及多肽药物的聚乙二醇化研究中，为保证偶联药物产品质量，通常采用重结晶方式对聚乙二醇衍生物进行精制处理，一方面，重结晶处理可获得外观均一、形态稳定的聚乙二醇衍生物，另一方面，通过重结晶处理能有效除去聚乙二醇衍生物中的小分子杂质，提高聚乙二醇衍生物纯度。用于药物聚乙二醇化的聚乙二醇衍生物又称为聚乙二醇修饰剂，指带有活性官能团的聚乙二醇，是经过活化的聚乙二醇，可用于蛋白质以及多肽药物修饰。

3、美国发明专利us005672662a公开了以冰乙醚为重结晶溶剂对聚乙二醇衍生物进行精制处理的操作。以乙醚为重结晶试剂时，不需要加热，然而乙醚沸点低，易挥发，冰乙醚的使用条件对周围环境温湿度具有较高要求，如控温不佳，聚乙二醇衍生物将溶解于乙醚，致使样品损失，且乙醚快速挥发时样品表面易凝结水珠，导致聚乙二醇衍生物吸潮，甚至降解变质，因此乙醚的产业化应用存在一定局限性。此外乙醚还具有麻醉性，在安全性方面也存在隐患。中国发明专利cn104497303a公开了以异丙醇为重结晶溶剂，采用加热方式对聚乙二醇衍生物进行精制处理的方法。以异丙醇为重结晶试剂时，异丙醇对聚乙二醇衍生物溶解度较低，样品损失小，但是处理大批量产品时，操作耗时长，存在导致聚乙二醇衍生物失活的风险，且除杂效果不理想，虽然可通过增加试剂用量缩短处理时长，提高除杂效果，但是这样将产生大量废液，不利于成本控制和生态环境。

技术实现思路

1、为克服上述现有技术的不足，本发明采用混合溶剂作为溶剂，提供一种具有广泛适用性的高效聚乙二醇衍生物的制备方法，以制备形貌均一、高纯度的聚乙二醇衍生物。本发明方法可应用于药物长效化，所制备的聚乙二醇修饰剂纯度高、均一性好，用于药物修饰更利于提高药物安全性，实现长效、缓释的效果。本发明制备方法同样可以应用于其他领域。

2、本发明提供的聚乙二醇衍生物的制备方法，包括以下步骤：

3、(a)按一定比例混合主溶剂和稀释剂，制备重结晶溶剂；

4、(b)向重结晶溶剂中加入一定量的聚乙二醇衍生物，氮气氛围下加热溶解；

5、(c)待聚乙二醇衍生物全溶后，反应体系降温，析出样品；

6、(d)过滤收集样品，干燥处理样品。

7、优选地，所述重结晶溶剂中，主溶剂为异丙醇或乙醇等，稀释剂为乙酸乙酯、正己烷、戊烷或甲基叔丁基醚等。

8、优选地，所述重结晶溶剂为异丙醇和乙酸乙酯的混合溶剂，异丙醇与乙酸乙酯的体积比为1:1～6:1，更优选2:1～5:1。

9、优选地，所述重结晶溶剂包括异丙醇和正己烷，异丙醇与正己烷的体积比为1:1～5:1，更优选1:1～3:1。

10、优选地，重结晶溶剂用量为聚乙二醇衍生物的5～20倍(v/w，ml/g)，更优选10～15倍(v/w，ml/g)。

11、本发明的聚乙二醇衍生物制备方法对聚乙二醇衍生物不作限定，适用于2000～80000da分子量中各种结构类型以及各种端基和连接基团的聚乙二醇衍生物，包括但不限于实施例所采用的如通式(i)所示的直链型聚乙二醇衍生物、通式(ii)所示的分支型聚乙二醇衍生物。

12、

13、

14、其中：

15、n是介于45～1820之间的整数，i是介于22～910之间的整数，m是介于2～8之间的整数；

16、r1为连接基团，选自—(ch2)j—，其中，j为2～8之间的整数；

17、x、y为连接基团，选自：—(ch2)k—、—(ch2)knh—、—(ch2)kocoo—、—(ch2)koconh—、—oc(ch2)kocoo—、—oc(ch2)kcoo—、—oc(ch2)kcoonh—等，k为0～8之间的整数；

18、u、z为端基，选自：h、c1-c6的烷氧基、烷基、羟基、氨基、巯基、羧基、醛基、炔基、叠氮基、氨甲基、琥珀酰亚胺乙酸酯、琥珀酰亚胺丙酸酯、琥珀酰亚胺丁酸酯、琥珀酰亚胺碳酸酯、琥珀酰亚胺琥珀酸酯、琥珀酰亚胺、丙烯酸、对硝基苯碳酸酯、马来酰亚胺、异氰酸等。

19、步骤(b)中，加热温度优选50～90℃，更优选60～80℃。在具体的实施例中采用的是70℃，但加热温度不限于此，针对具体的溶剂体系，选择合适的加热温度使得目的产物充分溶解即可。

20、步骤(c)中，反应体系降温优选-10～5℃，更优选-5～0℃。在具体的实施例中采用的是0℃，但降温温度不限于此，针对具体的溶剂体系，选择合适的降温温度使得目的peg衍生物析出、与杂质分离即可。

21、步骤(d)中，聚乙二醇衍生物的过滤可采用但不限于常压、减压、加压等方式，干燥处理可采用但不限于真空干燥、鼓风干燥、氮吹等方式，能够达到过滤和干燥效果的方式均可使用。在具体的实施例中采用的是加压过滤、真空干燥。

22、本发明还涉及所述聚乙二醇衍生物制备方法在药物长效化中的应用。药物的聚乙二醇化对聚乙二醇修饰剂的纯度要求较高，用本发明的制备方法对聚乙二醇修饰剂进行重结晶，可有效去除聚乙二醇修饰剂中的小分子杂质，获得外观均一、形态稳定、纯度高的聚乙二醇修饰剂，与药物偶联可成功制备聚乙二醇化的长效化药物。在具体的实施例中，用本发明的重结晶方法对单甲氧基聚乙二醇(10000da)琥珀酰亚胺丙酸酯(mpeg-spa-10k)进行重结晶，将重结晶产物用于猪胰激肽释放酶i和重组人激肽释放酶i的修饰，体外实验显示，与未聚乙二醇化的猪胰激肽释放酶i和重组人激肽释放酶i相比，聚乙二醇化的猪胰激肽释放酶i和重组人激肽释放酶i对底物的亲和力降低，效应分子的释放更为温和持续；体内实验显示，与未聚乙二醇化的重组人激肽原酶i相比，经聚乙二醇衍生物修饰的重组人激肽原酶i具有显著的脑保护作用，能有效治疗动物脑卒中后的神经缺陷症状，改善脑梗死面积，结合体外试验结果可知，聚乙二醇化的重组人激肽原酶i具有聚乙二醇药物安全、缓释、长效的优势。

23、与现有技术相比，本发明具有以下优势：

24、本发明采用由主溶剂和稀释剂组成的混合溶剂作为重结晶溶剂，相比现有技术可显著提高处理效率和处理效果。本发明所用重结晶溶剂易于温控，可操作性高，能避免聚乙二醇衍生物在重结晶过程中降解变质及产生损耗，除杂效果优越，并且所用成分毒副作用小，安全风险可控。另一方面，本发明在提升聚乙二醇衍生物结晶处理效果的同时，减少了溶剂总用量，处理时长显著缩短，极大提高了处理效率。相较于现有技术采用冰乙醚或单一异丙醇作重结晶溶剂的工艺，本发明很好地解决了现有技术存在的可操作性差、处理效率低、损耗高及溶剂用量大、成本高等问题，不存在安全隐患，具有良好的经济效益和应用前景。本发明还进一步优化了重结晶溶剂中主溶剂与稀释溶剂的比例以及反应体系中重结晶溶剂与聚乙二醇衍生物的比例，并对加热温度和冷却温度进行优化，进一步提高了处理效率以及处理效果。

25、本发明的方法能够有效去除聚乙二醇修饰剂中的小分子杂质，获得外观均一、形态稳定、纯度高的聚乙二醇修饰剂，更利于长效化药物制备，以提高药物安全性，实现长效、缓释的效果。

26、附图中展示的是本发明的部分实验结果。