3-甾酮-delta1-脱氢酶及其在制备1,4-雄烯二酮中的应用的制作方法

本发明属于医药领域，具体涉及一种3-甾酮-δ1-脱氢酶及其在制备1,4-雄烯二酮中的应用。

背景技术：

1、甾体激素类药物是临床上一类重要药物，被广泛用于预防及治疗各种疾病。当甾体母核结构发生变化时，可能会变化成更为有效的甾体药物；如醋酸可的松c1,2位上引入双键后变成醋酸泼尼松，抗炎作用能够提高3-4倍。利用化学法进行c1,2脱氢反应一般使用二氧化硒法，该方法一般在产物中会残留部分对人体有害的硒，且化学法具有毒性大、收率低、环境污染大等缺点；相比较而言使用酶法转化进行c1,2位脱氢反应就成了较好的选择。随着生物发酵以及酶催化技术得到发展，发酵以及酶催化法制备部分甾体化合物逐渐替代了化学合成的方法，酶法相较于化学法存在着转化效率高、环境污染小、副产物少等优点。

2、雄烯二酮(4ad)进行c1,2位脱氢反应生成1,4-雄烯二酮(add)，add是合成一些高端甾体药物如雌激素、孕激素的重要前体物质。尽管使用发酵技术转化4ad、add等技术已日趋成熟，但是在发酵过程中还是出现一些其他副反应及杂质，且转化效率有待进一步提高。专利cn102703494a中公开了一种利用重组枯草芽孢杆菌全细胞转化4-ad生成add的方法，将新金分支杆菌的3-甾酮-delta1-脱氢酶(3-甾酮-δ1-脱氢酶，3-ketosteroid-delta1-dehydrogenase，kstd)外源表达到枯草芽孢杆菌中，与对照菌株相比，显著提高了菌株的酶活力，但是以0.1％(w/v)4-ad为底物时，底物的转化率仅为65.7％。专利cn106636160a公开了一种来源于新金分支杆菌的kstd，将该基因在大肠杆菌bl21中过量表达，所获得的基因工程菌株在投料浓度仅为0.1％(w/v)时，转化4-ad为add的底物转化率仅为76.5％。

3、综上所述，现有技术中将不同来源的kstd酶基因外源表达到不同宿主中，利用重组菌株进行生物转化4-ad制备add仍有底物投料浓度小、转化率低等不足。因此，获得一种转化效率高、收率高、产物单一、不产生其他副产物的add制备方法具有重要意义。

技术实现思路

1、为解决现有技术中缺乏底物投料量高、转化率高的1,4-雄烯二酮生产方法的问题，本发明提供一种3-甾酮-δ1-脱氢酶及其在制备1,4-雄烯二酮中的应用。本发明提供的3-甾酮-delta1-脱氢酶(3-甾酮-δ1-脱氢酶，3-ketosteroid-δ1-dehydrogenase,kstd)在制备1,4-雄烯二酮中，具有底物投料量高、转化率高、收率高、产物单一、产物纯度高和环境友好的优点。

2、本发明通过以下技术方案解决上述技术问题：

3、本发明第一方面提供一种3-甾酮-δ1-脱氢酶，所述3-甾酮-δ1-脱氢酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。

4、本发明第二方面提供一种分离的核酸，其特征在于，所述核酸编码如第一方面所述的3-甾酮-δ1-脱氢酶；

5、本发明一些具体的实施方案中，所述核酸的核苷酸序列如seq id no:2所示。

6、本发明第三方面提供一种重组表达载体，所述重组表达载体包含如第二方面所述的核酸。

7、本发明一些实施方案中，所述重组表达载体的骨架质粒为pet26b或pet28a。

8、本发明第四方面提供一种转化体，所述转化体包含如第二方面所述的核酸或如第三方面所述的重组表达载体。

9、本发明一些实施方案中，所述转化体的底盘菌为大肠杆菌(escherichia coli)，例如为大肠杆菌bl21(de3)。

10、本发明第五方面提供一种制备3-甾酮-δ1-脱氢酶的方法，所述方法包括将如第四方面所述的转化体在适合的培养基中生长并表达所述3-甾酮-δ1-脱氢酶的步骤。

11、本发明一些较佳的实施方案中，所述方法包括：

12、(1)将含所述转化体的种子液接种于培养基中进行培养；

13、(2)添加诱导剂后继续培养；

14、(3)对经步骤(2)所得的菌体进行破碎，收集上清液。

15、本发明一些更佳的实施方案中，所述方法包括以下一种或多种条件：

16、(1)中，所述的培养的温度为30-37℃，例如为30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃，培养基的od600nm达到0.5-1.0，所述种子液的接种量为1-5％例如为1％、2％、3％、4％或5％，和/或所述培养基为lb培养基，所述百分比为体积百分比；

17、(2)中，所述诱导剂为异丙基-β-d-硫代半乳糖苷，所述诱导剂的浓度为0.3-0.5mm例如0.4mm，所述继续培养的温度为20-25℃，例如为20℃、21℃、22℃、23℃、24℃或25℃，和/或所述继续培养的时间为18-20h，例如为18h、19h或20h；

18、(3)中，所述破碎为低温破碎。

19、本发明第六方面提供一种1,4-雄烯二酮的制备方法，所述制备方法包括将如第一方面所述的3-甾酮-δ1-脱氢酶、如第四方面所述的转化体或如第五方面所述方法制备的3-甾酮-δ1-脱氢酶与底物接触进行反应的步骤；所述底物为雄烯二酮或睾酮；

20、本发明一些实施方案中，所述制备方法包括向反应体系中通氧的步骤。

21、本发明一些优选实施方案中，反应体系处于纯氧气氛。

22、本发明一些实施方案中，所述制备方法包括产物精制的步骤。

23、本发明一些实施方案中，所述3-甾酮-δ1-脱氢酶的使用形式为液态酶、固态酶、固定化酶、湿菌体或菌粉。

24、本发明相关实施方案中，固定化酶指的是将上述液体酶中的酶组分固定在固定化载体上而得。固定化载体为树脂，优选地为环氧树脂、氨基树脂或吸附树脂。湿菌体指的是表达了所述酶的菌体的发酵培养液经离心后所得到的沉淀物。菌粉指的是对上述湿菌体经干燥以脱掉溶剂水并且经粉碎后得到的粉状物。

25、本发明一些实施方案中，所述液态酶为粗酶液，所述固态酶为酶粉。

26、本发明相关实施方案中，所述粗酶液是采用溶剂(例如水或缓冲液)对湿菌体进行重悬和均质后得到的均质酶液。酶粉指的是将上述液态酶经干燥和粉碎后得到的粉末物，所述干燥例如冷冻干燥。

27、本发明中，所述粗酶液的一个制备示例为将表达所述3-甾酮-δ1-脱氢酶的菌体使用缓冲液按菌体：缓冲液＝1:4(g/ml)的比例进行重悬，高压均质机以1000bar低温破碎10-20min破碎2-3次，12000-13000r/min离心10-15min后，取上清液即得。所述缓冲液为磷酸盐缓冲液，ph为7-7.5。

28、本发明中，所述酶粉的一个制备示例为将上述粗酶液进行冻干处理即得。

29、本发明一些实施方案中，所述3-甾酮-δ1-脱氢酶的使用形式为粗酶液，反应体系中所述底物与粗酶液的质量/体积比为(20-10):1，例如为20:1、18:1、16:1、14:1、12:1或10:1，所述体积/质量比的单位为g/ml。

30、本发明一些实施方案中，所述底物的终浓度为10-100g/l，例如为10g/l、20g/l、30g/l、40g/l、50g/l、60g/l、70g/l、80g/l、90g/l或100g/l。

31、本发明一些实施方案中，所述制备方法包括加入电子受体例如为甲萘醌。

32、本发明一些较佳的实施方案中，所述电子受体为0.1％-1％甲萘醌，所述百分比为甲萘醌与底物的质量百分比。

33、本发明一些更佳的实施方案中，所述电子受体为0.5％-1％甲萘醌，所述百分比为甲萘醌与底物的质量百分比。

34、本发明一些实施方案中，所述制备方法包括加入乳化剂，所述乳化剂选自聚乙二醇、异丙醇、dmso、triton-x100和吐温80中的一种或多种。

35、本发明一些较佳的实施方案中，所述乳化剂为聚乙二醇和/或异丙醇。

36、本发明一些更佳的实施方案中，乳化剂为1-5％聚乙二醇，例如为1％、2％、3％、4％或5％聚乙二醇，和/或1％异丙醇，所述百分比为体积百分比。

37、本发明一些实施方案中，所述反应的ph为7.0-8.0，例如为7.0、7.5或8.0。

38、本发明一些实施方案中，所述反应的温度为30-37℃，例如为30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃或37℃。

39、本发明一些实施方案中，反应时间为18-24h，例如为18h、20h、22h或24h。

40、本发明一些实施方案中，所述反应结束后，还包括萃取的步骤。

41、本发明一些实施方案中，所述产物精制包括：助滤剂处理、过滤、加入溶剂、回流、浓缩和析出产物的步骤。

42、本发明一些较佳的实施方案中，所述助滤剂为硅藻土；和/或，所述溶剂为甲醇；和/或，所述回流的温度为65-70℃，例如为65℃、66℃、67℃、68℃、69℃或70℃；和/或，所述回流的时间为0.5-1h，例如为0.5或1h。

43、本发明第七方面提供一种如第一方面所述的3-甾酮-δ1-脱氢酶、如第二方面所述的核酸、如第三方面所述的重组表达载体或如第四方面所述的转化体在制备1，4-雄烯二酮中的应用。

44、在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

45、本发明所用试剂和原料均市售可得。

46、本发明的积极进步效果在于：本发明提供的3-甾酮-δ1-脱氢酶在制备1，4-雄烯二酮中，具有生产流程简单、底物投料浓度高(高至40g/l)、转化率高(高至97％以上)、收率高(90％以上)、产物单一、产物纯度高(高至99％以上)、可催化多种底物(例如底物可为1,4-雄烯二酮和睾酮)和环境友好的优点。