基于G-四链体的核酸分子及其应用

本发明属于生物，涉及一种基于g-四链体的核酸分子，本发明还涉及所述基于g-四链体的核酸分子的应用，本发明还涉及使用所述基于g-四链体的核酸分子从黄连中提取表小檗碱的方法。

背景技术：

1、黄连是常用的中药，《中国药典》收录黄连为毛茛科植物黄连coptis chinensisfranch.、三角叶黄连coptis deltoidea c.y.cheng et hsiao或云连coptis teeta wall.的干燥根茎。黄连味苦，性寒，有泻火、解毒、清热、燥湿的功能。近年来的药理学研究表明黄连在抗癌、杀菌消炎、降压、清热解毒等方面具有显著的疗效。黄连中主要起活性的小分子是一类生物碱分子，包括小檗碱、表小檗碱、黄连碱、药根碱、巴马汀等。尽管小檗碱的含量最高并被证实有一定的生物治疗活性，其他生物碱如表小檗碱在近些年来的研究中亦被证实为低毒的具有抗癌和杀菌等活性候选药物。由于黄连中生物碱分子的化学性质、化学结构极其类似，因此如何高效的分离提纯黄连各生物碱小分子具有重要的意义。

2、现有技术中，通常使用液相色谱法分离黄连粗提取中的生物碱分子，例如刘朝亮等[高速逆流色谱法制备岩黄连中的脂溶性生物碱，时珍国医国药，2010年11期]采用正己烷-醋酸乙酯-甲醇-水(3∶7∶5∶5；1.5∶5∶1.5∶5)、正己烷-醋酸乙酯-甲醇-0.2mol/l盐酸(1∶3.5∶2.5∶4.5)，上相作固定相，下相作流动相，用高速逆流色谱法对岩黄连中的脂溶性生物碱进行制备分离，从岩黄连的醋酸乙酯粗提物中得到cheilan-thifoline(纯度:76.1％)、thalictrifoline(纯度:83.1％)、tetrahydropalmatine(纯度:85.5％)、cana-dine(纯度:78.5％)4个纯度较高的脂溶性生物碱。褚建军等，制备型高速逆流色谱分离中药中的生物碱，浙江工业大学学报，2006年01期]以氯仿∶甲醇∶0.1mol/l稀盐酸＝2∶1∶1为溶剂体系，用高速逆流色谱从黄连中分离得到巴马汀、小檗碱、表小檗碱、黄连碱。

3、现有技术中，运用液相色谱法来分离提纯黄连中生物碱的技术方案还可以如下：流动相a一般为含有0.1％三氟乙酸或0.2％亚磷酸的水，流动相b一般为含酸的乙腈或甲醇。柱温范围位于30℃至45℃之间，常用的检测波长为270nm或337nm。一般采用梯度洗脱，流速一般为0.8ml/min，1ml/min和1.5ml/min。

4、显然地，这些方法均需要通过反复多次的吸附-解吸的分配过程，继而在移动速度上产生较大的差别造成从色谱柱中流出的保留时间不同，通过这种差异分离提取出黄连中各种生物碱成分。因此，使用液相色谱法分离提纯黄连中表小檗碱的缺点明显，例如对于仪器平台及色谱柱材料的依赖性强，一般需要具备反式色谱柱的；良好的高效液相色谱仪平台；所使用的化学试剂对于环境不友好，例如所使用的三氟乙酸、甲醇、乙腈等；分离提取成本较高，例如对于流动相溶剂的纯度有较高要求，并且每次用量较大；以及每次提纯的上样量有限从而限制整体工作效率等。

5、因此，当前对制备高效，操作简单、环境友好的表小檗碱的制备方法存在需求。

技术实现思路

1、因此，本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一种特异性结合表小檗碱的基于g-四链体的核酸分子，并且提供了使用所述特异性结合表小檗碱的基于g-四链体的核酸分子提取表小檗碱的方法。

2、与现有技术相比，本发明的方法环境友好，操作简单，并且能实现对黄连中生物碱分子，尤其是表小檗碱的有效提取。

3、本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

4、本发明的第一方面提供一种特异性结合表小檗碱的基于g-四链体的核酸分子，所述基于g-四链体的核酸分子包含式i所示的dna序列或其变体：

5、5’-(ttaggg)ntta-3’

6、式i

7、其中，所述n为≥4的整数，优选地为独立地选自4～12的整数，优选地为n为4或n为8。

8、在一个优选的实施方案中，当n为4-7时，所述基于g-四链体的核酸分子还包括另外的核酸以在5’端形成发夹结构或互补双链结构。

9、优选地，所述n为4时，所述基于g-四链体的核酸分子还包括另外的核酸以在5’端形成发夹结构或互补双链结构。

10、优选地，所述另外的核酸选自以下的dna序列：

11、5’-cctggcttcggccagg-3’(seq id no:8)、

12、5’-acctggcttcggccagg-3’(seq id no:9)。

13、优选地，(ttaggg)n重复单元中，用于连接另外的核酸的单元中包含t→a的突变，例如用于连接另外的单元的ttaggg变化为taaggg。

14、在一个优选的实施方案中，当n为8时，所述基于g-四链体的核酸分子为：

15、5’-(ttaggg)4-l-(ttaggg)4tta-3’

16、其中，所述l为连接子，例如，所述l为一个、两个或三个脱氧核糖核苷酸，例如为t、tt或tta。

17、在一个优选的实施方案中，所述基于g-四链体的核酸分子包含与seq id no:1-7中任一项所示的dna序列，或者与seq id no:1-7中任一项所示的dna序列具有高同源性并且能够特异性结合表小檗碱的序列；或者所述基于g-四链体的核酸分子包含由seq id no:1-7中任一项所示的dna序列衍生的能够特异性结合表小檗碱的序列。

18、seqidno:1

19、seqidno:25’-acctggcttcggccaggttagggttagggttagggttagggtta-3’(q4-ds-a)

20、seqidno:3

21、seqidno:4

22、seqidno:55’-ttagggttagggttagggttagggtttagggttagggttagggttagggtta-3’(q8-t)

23、seqidno:65’-ttagggttagggttagggttagggttttagggttagggttagggttagggtta-3’(q8-tt)

24、seqidno:75’-ttagggttagggttagggttagggttattagggttagggttagggttagggtta-3’(q8-tta)。

25、在一个优选的实施方案中，所述基于g-四链体的核酸分子包含如seq id no:2或seq id no:5所示的dna序列。

26、具体地，申请人发现，表小檗碱与基于g-四链体的核酸分子之间的结合亲和力在μm级别，而本发明中提供基于g-四链体的核酸分子与表小檗碱之间的结合亲和力可以达到nm级别，其中某些特定的基于g-四链体的核酸分子，与表小檗碱的亲和力达到8±2nm，展现出较高的亲和力。

27、作为本发明的一种优选方案，所述基于g-四链体的核酸分子的序列还可以进一步包含碱基修饰。

28、其中，所述碱基修饰能够使所述基于g-四链体的核酸分子与未修饰之前相比，具有更高的亲和力。

29、作为本发明的一种优选方案，所述碱基修饰为硫代修饰、磷酸化修饰、甲基化修饰、氨基化修饰、巯基化修饰、硒取代氧修饰或连接同位素修饰。

30、作为本发明的一种优选方案，所述基于g-四链体的核酸分子的核苷酸序列包含标记物。

31、作为本发明的一种优选方案，所述标记物为荧光标记物，放射性标记物、治疗性标记物、生物素标记物、地高辛标记物、纳米发光材料标记物、小肽标记物、sirna标记物或酶标记物。

32、本发明的第二方面提供所述包含上述能够特异性结合表小檗碱的基于g-四链体的核酸分子的试剂盒。

33、本发明的第三方面提供了上述能够特异性结合表小檗碱的基于g-四链体的核酸分子的用途。

34、作为本发明的一种优选方案，所述用途为检测表小檗碱的用途。

35、作为本发明的一种优选方案，所述用途为从黄连中提取表小檗碱的用途。

36、本发明的第四方面提供了一种从黄连中提取表小檗碱的方法，所述方法包括使用上述能够特异性结合表小檗碱的基于g-四链体的核酸分子的步骤。

37、在一个优选的实施方案中，所述方法为磁珠法、色谱柱法或超滤法。

38、在一个优选的实施方案中，所述方法为磁珠法，并且包括以下步骤：

39、1)获取黄连粗提取物；

40、2)将本发明的基于g-四链体的核酸分子与磁珠接触，从而使所述基于g-四链体的核酸分子固定到磁珠上；

41、3)在含钾离子的环境中，使步骤2得到的磁珠与步骤1的黄连粗提取物接触并温育；

42、4)将步骤3)的磁珠转移至不含钾离子的环境中，取上清液，得到纯化的表小檗碱溶液。

43、所述方法为色谱柱法，并且包括以下步骤：

44、1)获取黄连粗提取物；

45、2)将本发明的基于g-四链体的核酸分子与固相亲和填料接触，从而使所述基于g-四链体的核酸分子共价地固定到所述固相亲和填料；

46、3)将所述固相亲和填料填充至亲和色谱柱；

47、4)在含钾离子的环境中，使步骤3)得到的亲和色谱柱与步骤1)的黄连粗提取物接触并温育；

48、5)使用不含钾离子的溶液作为洗脱液，洗脱，得到纯化的表小檗碱溶液；或者

49、所述方法为超滤法，并且包括以下步骤：

50、1)获取黄连粗提取物；

51、2)在含钾离子的环境中，将本发明的基于g-四链体的核酸分子与步骤1)的黄连粗提取物接触并温育；

52、3)使用截留分子量不低于2000da的超滤膜离心超滤，并保留未透过物质；

53、4)用不含钾离子的溶液作为洗脱液离心洗脱步骤3)的未透过物质，得到纯化的表小檗碱溶液。

54、优选地，所述方法还包括将得到的表小檗碱溶液浓缩，结晶，以获得表小檗碱晶体的步骤。

55、优选地，所述方法还包括使用离子交换树脂法除去钠离子的步骤。

56、优选地，在步骤1)中，所述黄连粗提取物可以为其黄连粗提取物的水溶液，其中所述水溶液的浓度可以为0.01～100mg/ml，例如可以为浓度(mg/ml)可以为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10或更高，例如0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0或更高，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更高，或其中任意数值等。

57、优选地，所述含钾离子的环境为含钾离子的无机盐溶液，例如kcl溶液。

58、优选地，所述钾离子的浓度为1～500mm，更优选为1～200mm，进一步优选为10-100mm，例如浓度(mm)可以为20、30、40、50、60、70、80、90等。

59、优选地，所述不含钾离子的环境为纯水、含钠离子的环境或盐酸溶液；更优选地，所述为含钠离子的环境为含钠离子的无机盐溶液，例如nacl。优选地，所述钠离子的浓度为1～200mm，更优选为100-200mm，例如可以浓度(mm)为110、120、130、140、150、160、170、180、190等。

60、在本技术中，发明人发现，特定的基于g-四链体的核酸分子能够与表小檗碱高特异性结合，并且其结合强度为小檗碱的数倍，例如五倍、十倍或更高，从而使用特定的基于g-四链体的核酸分子可以将表小檗碱从各种生物碱中分离出来。进一步地，本发明的特定的基于g-四链体的核酸分子在钾离子环境下能够与表小檗碱的强结合作用，而在钠离子环境下能够与表小檗碱的解离。同时，基于g-四链体的核酸分子能够与磁珠共价耦合。综上，本发明的方法基于特定的基于g-四链体的核酸分子能够与表小檗碱高特异性结合、磁珠与核酸分子的共价耦合、以及表小檗碱在不同离子环境下的结合和解离，实现了表小檗碱从黄连提取物的高效率的分离提纯，具有意料不到的技术效果。

61、与现有技术相比，本发明具有以下优点：

62、本发明提供了一种能够特异性结合表小檗碱的基于g-四链体的核酸分子。

63、本发明提供的基于g-四链体的核酸分子与磁珠紧密结合的基础上，还能与表小檗碱具有很强的结合力。因此，通过调控水溶液的离子环境就能实现本发明的基于g-四链体的核酸分子与表小檗碱的高效的结合与解离的调控，从黄连中有效提取表小檗碱。

64、与传统的液相色谱法分离提纯相比，本发明的从黄连中提取表小檗碱的方法不涉及有机试剂的使用，对环境更加友好；避免了昂贵的高效液相色谱仪平台的使用；进一步地，本发明仅通过调控水溶液的离子环境就能实现对表小檗碱的高效提取，具有广泛的应用前景。

65、通过所附附图和实施例来示例说明本发明。这些实施例不是对本发明的限制。