一种生产β-丙氨酸的菌株及其构建方法和应用与流程

本发明属于生物，涉及生产β-丙氨酸的菌株。

背景技术：

1、β-丙氨酸又称β-氨基丙酸，分子式为c3h7o2，相对分子量为89.094，是自然界中唯一存在的β-型氨基酸，是一种非蛋白氨基酸，可以作为食品添加剂，改善食物口感、保鲜和防氧化等，在食品、医药、饲料等领域具有重要的应用价值和产业化制备需求。

2、在β-丙氨酸的制备上，目前工业化制备主要通过化学合成法实现，但制备反应过程需要提供苛刻的条件，大大增加了成本和环境污染的可能性。生物制造主要以体外酶催化和生物发酵为主要技术手段。β-丙氨酸的体外酶催化制备通常以l-天冬氨酸为反应底物，成本上不具备优势。生物发酵技术过程容易控制，且原料成本相对较低，是目前氨基酸、有机酸产业化生产的重要手段，目前依然有发展和提升的空间。

技术实现思路

1、基于此，本发明在现有技术基础上，改善重组大肠杆菌生产β-丙氨酸的能力，提高β-丙氨酸在发酵液中的浓度和产量。

2、在第一个方面，本发明提供一种生产β-丙氨酸的菌株的构建方法，包括：

3、(1)以大肠杆菌为出发菌株，转入ppc基因、aspc基因、pand基因；

4、(2)敲除菌株基因组中的ptsg基因，将外源ptsg基因整合至菌株基因组中，从而替换菌株中原来的ptsg基因。

5、在一些实施方式中，

6、所述ppc基因的核苷酸序列如seq id no:1所示，其编码的氨基酸序列如seq idno:2所示；

7、所述aspc基因的核苷酸序列如seq id no:3所示，其编码的氨基酸序列如seq idno:4所示；

8、所述pand基因的核苷酸序列如seq id no:5所示，其编码的氨基酸序列如seq idno:6所示；

9、所述外源ptsg基因的核苷酸序列如seq id no:7所示，其编码的氨基酸序列如seqidno:8所示。

10、在一些实施方式中，所述ppc基因、aspc基因、pand基因通过质粒转化进入大肠杆菌中。优选地，三个基因构建成一个或多个质粒转入大肠杆菌中。进一步优选地，所述原始质粒为pacycduet1。

11、在一些实施方式中，所述大肠杆菌为大肠杆菌dh5α或大肠杆菌bl21。

12、在一种具体实施方式中，所述构建方法为gibson组装。

13、在第二个方面，提供一种生产β-丙氨酸的菌株，通过本发明的构建方法得到。

14、在第三个方面，提供本发明的生产β-丙氨酸的菌株在制备β-丙氨酸中的应用。

15、在第四个方面，提供一种生产β-丙氨酸的方法，所述方法包括，发酵本发明的生产β-丙氨酸的菌株。

16、在一些优选实施方式中，所述发酵包括好氧阶段和厌氧阶段，所述好氧阶段转速150-800rpm，通气50-200l/h，温度37℃；当od600达到20时转厌氧阶段，厌氧阶段温度40℃，转速200rpm，不通气发酵。

17、在一些优选实施方式中，所述发酵的培养基成分为30-80mg/lmgso4·7h2o、10-20g/lna2hpo4·12h2o、20-30g/l kh2po4、0.5-2.5g/l(nh4)2so4、0.2-0.8mg/lniso4·7h2o、0.5-2ml/l微量元素，微量元素可以购买，其成分主要为：钼酸铵、硫酸铜、乙二胺四乙酸二钠铁、硼酸、硫酸锰、硫酸锌。

18、在一些优选实施方式中，发酵之前，先培养菌株种子，选择lb液体培养基在37℃、200rpm下培养12-14h，接种至发酵罐时，种子接种量可以是2％-10％，优选使用4％(v/v)接种量进行发酵。

19、在第五个方面，提供一种ptsg蛋白，其氨基酸序列如seq id no:8所示。以及，提供编码该蛋白的核酸分子，优选地，所述核酸分子的序列如seq id no:7所示。

20、在第六个方面，提供本发明的ptsg蛋白或编码该蛋白的核酸分子在构建生产β-丙氨酸的菌株中的应用。

21、本发明从β-丙氨酸tca循环还原分支途径出发，利用新的ptsg基因替换大肠杆菌基因组中的ptsg基因，并转入β-丙氨酸合成的tca循环还原分支途径中的关键酶基因，有效提高了大肠杆菌中β-丙氨酸产量。

技术特征：

1.一种生产β-丙氨酸的菌株的构建方法，包括：

2.根据权利要求1所述的构建方法，其中，所述ppc基因、aspc基因、pand基因通过质粒转化进入大肠杆菌中，三个基因构建成一个或多个质粒转入大肠杆菌中；优选地，所述原始质粒为pacycduet1，所述构建方法为gibson组装；优选地，所述大肠杆菌为大肠杆菌dh5α或大肠杆菌bl21。

3.一种生产β-丙氨酸的菌株，由权利要求1或2所述的构建方法得到。

4.权利要求3所述的生产β-丙氨酸的菌株在制备β-丙氨酸中的应用。

5.一种生产β-丙氨酸的方法，包括发酵权利要求3所述的生产β-丙氨酸的菌株。

6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述发酵包括好氧阶段和厌氧阶段，所述好氧阶段转速150-800rpm，通气50-200l/h，温度37℃；当od600达到20时转厌氧阶段，厌氧阶段温度40℃，转速200rpm，不通气发酵；

7.根据权利要求5或6所述的方法，其中，发酵之前，先培养菌株种子，选择lb液体培养基在37℃、200rpm下培养12-14h，接种至发酵罐时，种子接种量是2％-10％(v/v)，优选使用4％(v/v)。

8.ptsg蛋白，其氨基酸序列如seq id no:8所示。

9.编码权利要求8所述的ptsg蛋白的核酸分子；优选地，所述核酸分子的序列如seq idno:7所示。

10.权利要求8所述的ptsg蛋白或权利要求9所述的核酸分子在构建生产β-丙氨酸的菌株中的应用。

技术总结本发明属于生物技术领域，提供生产β‑丙氨酸的菌株及其构建方法。所述构建方法包括：(1)以大肠杆菌为出发菌株，转入ppc基因、aspc基因、pand基因；(2)敲除菌株基因组中的ptsG基因，将外源ptsG基因整合至菌株基因组中，替换菌株中原来的ptsG基因。通过本发明方法构建的菌株其β‑丙氨酸产量有明显提升。技术研发人员：赵伟,王竞辉受保护的技术使用者：万华化学集团股份有限公司技术研发日：技术公布日：2024/6/18